猪常态离体肝灌注

摘要

此处描述的猪肝脏常温机器灌注 （NMP） 模型可以成功地用于研究 NMP 作为保存策略、活力评估工具和器官修复平台。它具有很高的转化价值，但它在技术上具有挑战性且劳动密集型。

摘要

肝脏 异位 常温机器灌注 （NMP） 的猪模型越来越多地用于移植研究。与啮齿动物相反，猪肝在解剖学和生理学上与人类相似，器官大小和胆汁组成相似。NMP 通过肝血管系统再循环温暖、含氧且营养丰富的红细胞灌注液，在接近生理条件下保留肝移植物。NMP 可用于研究缺血再灌注损伤，移植前 原位 保留肝脏，植入前评估肝脏功能，并为器官修复和再生提供平台。或者，可以使用带有全血灌注液的 NMP 来模拟移植。然而，这种模式是劳动密集型的，在技术上具有挑战性，并且财务成本很高。

在这个猪 NMP 模型中，我们使用温缺血受损的肝脏（对应于循环死亡后的捐赠）。首先，开始全身麻醉和机械通气，然后通过夹住胸主动脉 60 分钟诱导热缺血。插入腹主动脉和门静脉的插管允许用保冷溶液冲洗肝脏。冲洗出的血液用细胞保存器清洗以获得浓缩的红细胞。肝切除术后，将插管插入门静脉、肝动脉和肝下腔静脉，并连接到由血浆扩容器和红细胞启动的封闭灌注回路。回路中包括一个中空纤维氧合器，并与热交换器耦合，以在 38 °C 时保持 70-100 mmHg 的 pO2。NMP 是通过直接通过动脉的连续流动和 通过 门静脉的静脉储液器实现的。持续监测流量、压力和血气值。为了评估肝损伤，在预定的时间点对灌注液和组织进行取样; 胆汁通过 胆总管中的套管收集。

引言

肝移植是终末期肝衰竭的唯一确定性治疗方法;然而，它的成功受到等待名单上的患者与潜在供体器官可用性之间持续不平衡的限制¹。为了增加供体库，在过去十年中，供体标准逐渐扩大，包括供体年龄较大、肝脂肪变性和循环死亡后捐献 （DCD） ^2,3。在 DCD 手术期间，肝脏在停止维持生命治疗、宣布死亡和原位冷却和保存之间总是会经历一段热缺血期，从而加重缺血再灌注损伤 （IRI）⁴。因此，DCD 肝脏与早期同种异体移植物功能障碍和胆道并发症的发生率增加有关 ^5,6。

对于这些高危供体肝脏，静态冷藏的常规保存并不能提供足够的 IRI 保护。迄今为止，常温机器灌注 （NMP） 等替代保存策略已获得相当大的关注。在常温机器灌注期间，肝脏 异位 连接到一个孤立的回路，并在体温下灌注含氧和营养丰富的灌注液。临床试验表明，NMP 可减少肝细胞损伤，这反映在转氨酶峰值释放减少和早期同种异体移植物功能障碍上⁷。然而，人们对 NMP⁸ 期间的肝细胞生物学知之甚少。

动物模型在肝移植的进化中起着关键作用。与啮齿动物模型相比，猪被认为具有更高的翻译价值，因为猪肝在解剖学和生理学上与人类接近，器官大小和胆汁组成相似。然而，猪肝移植模型是劳动密集型的，难以标准化，并且财务成本要高得多。

猪肝 NMP 可用于不同的目的。当使用基于全血的灌注液时，它可以应用于模拟异位移植，使用白细胞耗尽的红细胞灌注液将供体肝脏保存在保护环境中，评估移植前异位预测肝功能的潜在生物标志物，或作为研究再生疗法的平台 ^9,10,11。

猪肝 NMP 模型的采用具有挑战性，而手术和灌注相关的技术方面几乎没有描述。在我们的研究实验室中，我们采用了 Butler 等人最初描述的 NMP 设置¹² 来开发和验证 24 小时猪 非原位 分离肝脏灌注模型，该模型可用于保存肝移植物以进行移植和模拟移植。在这里，我们描述了一个分步协议;方法框架和潜在陷阱在别处公布⁹.

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研究方案

所有实验均在鲁汶大学动物护理委员会批准后进行，并符合欧洲指南。

1. 动物信息

注意：本研究方案使用雄性 TOPIGS TN70 猪，年龄为 3 个月大，体重约为 30 公斤，肝脏重量为 600-700 克。

1. 将动物放在单个围栏中 12 小时的昼夜节奏下，可以自由获取食物和自来水，以及它们之间的视觉、嗅觉和听觉接触。
2. 确保动物至少在手术前 2 天到达，以适应周围的环境。手术前将猪禁食 12 小时，可自由饮水。
   注意：用异氟醚维持麻醉，用芬太尼镇痛。在整个麻醉过程中，持续监测心电图、脉搏血氧饱和度、二氧化碳图和血压。实验是终结的;猪通过放血对猪实施安乐死，同时在持续的全身麻醉和镇痛下获得肝脏。

2. 灌注装置的准备

1. 一次性灌注套件的安装
   1. 将储液器固定在比肝脏容器高约 15 cm 的固定高度。
   2. 将泵头连接到离心泵上的指定插槽。将氧气管连接到氧合器。将加热器/冷却器的进出管连接到氧合器上的指定插槽。
   3. 在储液罐下方的流出管上安装一个夹管。在 Y 型连接后，将第二个夹管安装在储液器的流入管上，另一根管将在那里为肝动脉供血。
      注意：第一个夹管阀将控制流入门静脉。关闭第二个夹管阀会增加流量，因此也会增加肝动脉中的压力。
   4. 将流量传感器安装在储液罐流出管上第一个夹管的远端。将第二个流量传感器安装在泵头的流入管上。
      注意：第一个流量传感器将测量流入门静脉的流量。第二个流量传感器将测量腔静脉的流出量。
   5. 从氧合器上切出管，并按正确方向插入动脉过滤器。
      注意：将管子剪断至氧合器后不超过 2 厘米;如果放置时间过长，当用 37 °C 灌注液灌注时，当管子变软时，管子会扭结。如果它仍然扭结，通过将动脉过滤器绑在储液器的支架上来支撑动脉过滤器。
2. 安装泄漏再循环管
   1. 灌注套件包含两根管，一个 3/16 端和一个 1/16 端。通过将 1/16 端插入 3/16 端，将两根管子相互连接。将 3/16 端连接到储液槽。
   2. 将管子安装在滚轮泵中，考虑旋转方向。设置正确的管径，并将速度设置为每分钟 15-18 转 （rpm）。将 1/16 端放入肝脏容器中，必要时固定。
3. 连续在线血气分析校准
   1. 打开气体分析仪并选择 Calibrate（校准）。
   2. 检查传感器包装上的正确序列号，然后按 OK。
   3. 从暗盒中取出动脉传感器支架，将传感器连接到它，顶部有一个蓝色的盖子，底部有一个白色的过滤器。
   4. 拧下并取下过滤器下方的白色盖子;不要拧下过滤器本身。松开顶部的蓝色通风帽，不要将其取下。将传感器和传感器支架牢固地插入校准盒中。
   5. 开始校准。校准完成后，从校准盒中取出传感器和传感器支架。取下底部的白色过滤器，并拧紧顶部的蓝色通风帽。
   6. 将传感器插入灌注套件的采样管路中。在灌注回路灌注之前，不要开始气体分析。
4. 电路启动
   1. 将输注管插入 500 mL 血浆扩张器袋中，并将其连接到储液槽上。将管夹放在储液槽流出管线上，并用 300 mL 血浆扩液器填充储液槽。
   2. 取下管夹，让等离子体膨胀器填充电路
   3. 给泵头和氧合器脱气。电路现已启动。打开加热器/冷却器并将其设置为 38 °C
5. 输液管线的准备
   1. 将 5 mL （25.000 U） 的 5 U/mL 肝素溶液吸入 50 mL 注射器中。再抽取 25 mL 的 0.9% NaCl 溶液，以获得总体积为 30 mL 的肝素溶液（输注速率：1 mL/h）。
   2. 将 5 g 牛磺胆酸钠溶于 50 mL 0.9% NaCl 中，并将其吸入 450 mL 0.9% NaCl 中，以达到 1% 浓度。需要总体积为 168 mL（输注速度：7 mL/h）。
   3. 将 2 mL （200 U） 的 100 U/mL 胰岛素溶液吸入 50 mL 注射器中。再抽取 28 mL 的 0.9% NaCl 溶液，以获得总体积为 30 mL 的胰岛素溶液（输注速率：1 mL/h）。
   4. 抽取 10 mL 甘氨酸缓冲液（稀释剂）并将其添加到 0.5 mg 小瓶依前列醇中。使用依前列醇试剂盒中提供的微生物过滤器，从 50 mL 注射器中含有用甘氨酸缓冲液复溶的依前列醇的小瓶中抽取 5 mL。再抽取 25 mL 的 0.9% NaCl 溶液，以获得总体积为 30 mL 的依前列醇溶液（输注速率：1 mL/h）。

3. 麻醉诱导

1. 镇静
   1. 准备一个装有 2 mg/kg 甲苯噻嗪和 8 mg/kg Zoletil（4 mg/kg Tiletamine 和 4 mg/kg Zolazepam）的注射器、一个装有 10 mL 0.9% NaCl 的注射器、一个三通阀、一根延长线和一个肌内注射 21 G 针头。
   2. 将针头放入臀肌，注射甲苯噻嗪和瓦他明混合物，并用 0.9% NaCl 冲洗延长线。15 分钟后，对猪进行镇静。
   3. 称量猪并将其运送到手术室。
2. 麻醉
   1. 打开呼吸机
   2. 将猪仰卧在手术台上并固定四肢。
   3. 用装有 1.5 L O₂、1.5 L 空气和 1% 异氟醚的通气面罩进行预充氧。
   4. 将饱和探头连接到尾部或耳朵上。连接三根心电图导联以进行持续监测。
   5. 将 22 G 导管插入耳静脉，连接到三通阀，然后以 400 mL/h 的速度开始静脉注射 （IV） 液体（血浆液）。
   6. 将含有 50 μg/mL 芬太尼的 60 mL 注射器放入自动注射器驱动器中。推注 1 mL，并以 0.16 mL/kg/h 的速率开始连续输注。
   7. 取下通气面罩并插入喉镜，提起会厌。将气管插管插入气管并给球囊充气以防止漏气。用胶带将管子固定在猪的鼻子上。
      注意： 取下通气面罩时，请关闭异氟醚。
   8. 将气管插管连接到呼吸机。
      注意：呼吸机设置：0.4 L 潮气量;0.5 kPa 平均气道压力;2.5 kPa 气道压力;0.5 kPa 呼气末正压;频率 15/min;4.7-5.3 kPa 呼气末 CO₂.
   9. 将二氧化碳图连接到气管插管。

4. 手术

1. 深静脉导管和动脉导管
   1. 用 betadine 对手术区域进行消毒，并在中线两侧放置窗帘。
   2. 从胸骨顶部的左侧横向到胸锁乳突肌做一个 7 厘米长的切口，并放置一个直立牵开器。
   3. 从外侧方向解剖肌肉上的皮下组织，并确定颈外静脉。解剖静脉，结扎侧枝（如果有）。
   4. 在颈外静脉周围放置两根 2/0 结扎线并系好颅结扎线。
   5. 从打结的结扎线上切开静脉尾部，并插入一根 12 French 静脉导管。
      注意：确保在插入前用肝素盐水冲洗静脉导管。
   6. 用第二个结扎线固定导管。如果耳静脉中的静脉导管脆弱或太小，请将静脉输液和芬太尼管路换成深静脉导管。否则，在将血液采集到细胞保存器之前不要使用它。
   7. 解剖胸锁乳突肌的内侧边缘并更换直立牵开器，打开外侧胸锁乳突肌和内侧气管之间的平面。
   8. 切除胸腺以露出颈动脉。对动脉重复步骤 4.1.4。
   9. 将动脉线沿尾部方向插入颈动脉并固定。将动脉管连接到压力监测仪的管路。
2. 主动脉和腔静脉夹层
   1. 进行从剑突到耻骨的中线剖腹手术。
      注意：在公猪中，从阴茎尾部切开中线外侧 1 厘米，以避免损伤皮下尿道。
   2. 横切脐韧带。放置腹部牵开器。将肠道向左外侧和颅骨拉动，以观察主动脉和腔静脉。
      注意：猪肠是非旋转的;因此，无需结肠动员即可进入腹膜后。
   3. 解剖髂分叉颅部约 3 cm 的主动脉，并在主动脉周围放置两根结扎线。
      注意：主动脉附近有一条大的淋巴管;小心不要损坏它，因为这会使手术区域模糊并使解剖复杂化。
   4. 在与主动脉相同的水平解剖腔静脉并放置两根结扎线。
3. 胃十二指肠韧带夹层
   1. 从胃十二指肠韧带的外侧开始解剖，解剖胆总管，并用血管环环绕。
   2. 将胆管缩回内侧，露出门静脉。切除门静脉外侧的一个大淋巴结
   3. 释放通往胰腺的门静脉;胃和胰腺通常有一个分支需要结扎和横断。用肝脏一侧的血管环和胰腺一侧的结扎线环绕门静脉。横向缩回门静脉，确保不要将其关闭。
   4. 确定肝总动脉并用血管环环绕它。
4. 胸主动脉夹层
   1. 拉动肝脏尾部，从肝上腔静脉向腹侧打开隔膜的中央肌腱部分。将食管缩回右侧，露出胸主动脉。
   2. 从周围组织中取出，小心不要损坏 azygos 静脉。
      注意：没有必要环绕胸主动脉;夹层应充分伸展以放置血管夹。
5. 细胞保护程序的制备
   1. 将储液槽挂在黑色环中，从适配器的单腿上取下盖子，然后将管子连接到采血储液槽底部的 3/8 英寸出口。
   2. 打开抽吸管/抗凝管的盖子，将其连接到采血储液器顶部边缘的 1/4 英寸进血口之一。
   3. 转动插入洗涤套件的碗;确保听到咔嗒声。
   4. 将管子放入滚轮泵和管子分配器中。
   5. 将柠檬酸盐磷酸葡萄糖腺嘌呤 （CPDA）-1 采血袋挂在杆上，并确保连接紧密。
      注：CPDA-1 血袋成分 （63 mL）：2.99 g/L 无水柠檬酸;26.3 g/L 柠檬酸钠;2.22 g/L 单硫草酸磷酸钠;31.9 g/L 葡萄糖一水合物;0.275 g/L 腺嘌呤。
   6. 将废液袋挂在机器侧面（确保其已正确关闭）并将其连接到清洗套件（黄色盖子）。
   7. 将两个 Y 形管（白色盖子）连接到一袋 3 L 的 0.9% NaCl 上。
   8. 将带有蓝色盖子的试管连接到采血储液槽底部的适配器管上。打开自体输血系统。
6. 主动脉和腔静脉插管
   1. 施用 500 IU/kg 肝素并使其循环 2 分钟。将尾部结扎在主动脉周围，并在主动脉中插入 20 French 套管并固定。对腔静脉重复相同的过程。
7. 为了模拟 DCD 手术，通过夹住胸主动脉一段时间（在本例中为 60 分钟）来诱导热缺血。
   注意：在热缺血期间，腔静脉和颈静脉引流打开，并开始将血液收集到细胞保存器中。这会导致猪放血。
8. 冲洗肝脏
   1. 在热缺血结束时，通过主动脉插管用 2 L 冰冷 （4-6 °C） 保存液开始冷冲洗，并通过局部应用冰泥冷却腹部。
      注：在冷冲洗过程中，所有剩余的血液被冲洗并收集到细胞保存器中。
   2. 当前 2 L 冲洗后，从主动脉中取出套管，在门静脉上结扎，并插管门静脉。然后，用血管环固定它。
   3. 用另外 2 L 冰冷 （4-6°C） 保存液 通过 门静脉冲洗肝脏。
9. 肝切除术
   1. 从腹部取出冰块。横切靠近胰腺的胆管。
   2. 取出门静脉插管并分开门静脉。将肠道向左缩回，露出肝下腔静脉。
   3. 从腹膜后解剖腔静脉，仅将颅静脉与肾静脉分开。解剖肝总动脉直至腹腔动脉，起源于主动脉。
      注意：切开正确的膈肌结层可以改善暴露。
   4. 分开胃十二指肠动脉，用主动脉的一块切开腹腔动脉。将靠近胃的小网膜沿颅骨向上横切至食管
   5. 通过切割左三角韧带来动员左肝。切开腔静脉左侧的隔膜。
   6. 通过从腹侧到背侧切开右横膈膜来动员右肝，从肝下腔静脉横断面向尾部结束。
   7. 切开肝上腔静脉并切开任何剩余的附件。肝脏现在是自由的;将其取出并放入装有冰水的碗中。
10. 后表过程
    1. 称量肝脏。用 25 French 套管插管门静脉并用结扎线固定。用 14 French 加固套管套管肝动脉并用结扎线固定。
    2. 插管肝下腔静脉，并将套管尖端置于静脉腔静脉引流的水平。用结扎线固定。
    3. 在隔膜边缘放一根荷包绳，以防止任何膈静脉出血，并系好肝上腔静脉。
    4. 将门静脉插管脱气，并使用 250 mL 冷血浆扩张器对门静脉进行后台冲洗。检查是否有任何泄漏。
       注意： 检查是否有足够的流出穿过腔管套管。
    5. 门静脉冲洗后，将管夹放在门静脉插管上，确保没有空气进入插管和门静脉。
    6. 对动脉插管进行脱气，并通过肝动脉冲洗 250 mL 冷血浆扩张器。检查是否有任何泄漏并夹住任何侧枝。将管夹放在动脉和腔静脉插管上。

5. 正常机器灌注

1. 灌注液
   1. 在后表制备过程中，将细胞保存器产生的、洗涤的红细胞添加到回路中，以获得所需的 30% 血细胞比容。启动泵，将红细胞与血浆扩容器混合。启动连续气体分析仪。
      注：获得所需血细胞比容的红细胞体积公式：（肝脏重量 + 启动体积）x 洗涤后所需的红细胞比容/血细胞比容。连续气体分析仪还提供灌注温度的反馈，该温度通常与加热器在 38 °C 时的设置相匹配。
   2. 向灌注液中加入 10 mL 10% 葡萄糖酸钙、2 mL 肝素 （10.000 IU） 和 750 mg 头孢呋辛，溶于 10 mL 0.9% NaCl 中。将手动气体混合器设置为 0.5 L/min FiO₂ 的 21%。
2. 开始灌注
   1. 打开压力传感器、流量传感器和滚轮泵以进行泄漏再循环。
   2. 将肝脏放入容器中。将管夹放在回路的入口和动脉流入管和腔静脉流出管上，并切出 Y 型连接器。
   3. 将插管连接到各自的进出管上，中间有一个 T 型连接件。防止空气进入回路。
   4. 在 T 型连接件上安装三向水龙头并将压力管路连接到它们。对管路进行零压力，并开始持续压力监测。
   5. 设置夹管阀，几乎完全关闭它们，以防止超生理流动和内皮应激。
   6. 从门静脉流口取下管夹开始灌注。在门式流入开始后，立即从腔体流出处取下卡箍并启动泵。泵速是压力控制的，因此腔内流出的压力应介于 -5 mmHg 和 -2 mmHg 之间。目标肝脏门静脉流速为 0.75 mL/min/g。
   7. 当门静脉灌注稳定且腔静脉压足够时，从动脉管上取下夹子。目标压力约为 55-60 mmHg，肝脏流量约为 0.25 mL/min/g。
3. 维持稳定的灌注血流动力学
   1. 用玻璃圆顶或保鲜膜覆盖肝脏，以防止热量从表面散失。
   2. 如果门口流量过高，请关闭门口流入管上的夹管。
   3. 如果腔静脉压力变得太负，则在腔静脉内产生真空的风险会增加。可以通过减慢泵速来抵消过高的负压。或者，增加通过门静脉的流入量通过为腔静脉提供更多的体积来降低负流出压力。
   4. 如果动脉压过低，可以通过增加泵速或关闭朝门静脉储液器方向的夹管阀来增加动脉压，以推动更多流量通过动脉流入管。
4. 采样
   1. 从腔体流出三通阀或氧合器和门式储液器之间的指定采样管线获取灌注液样品。
   2. 在整个灌注过程中进行穿刺活检。必须缝合针孔，因为由于回路的肝素化而没有凝血。
   3. 通过将 8 French 套管固定在胆管中来收集胆汁。确保结扎胆囊管。

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结果

提出的灌注方案利用肝脏血流的自我调节来实现长达 24 小时的稳定血流动力学条件，并模拟门静脉和肝动脉中血流的生理分布。 图 1 显示了灌注回路的示意图。 图 2A 显示了血流的一致分布，门静脉和肝动脉分别贡献了大约 75% 和 25% 的总肝流量（在下腔静脉水平测量）。 图 2B 显示稳定的肝内血管阻力?...

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讨论

在这里，我们详细介绍了我们在猪肝 NMP 方面的经验。该技术的优点包括高翻译价值和多功能性。猪肝 NMP 可用于研究和增加对这种增强保存技术的理解，或者用于模拟移植。这种设置允许手动控制灌注的各个方面，从而能够以各种方式调整门静脉和动脉压力和流量。

为了尽可能接近地模拟临床实践，猪肝切除术的进行方式与人类供体类似，这意味着...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alaris GH Plus syringe pump	BD Care Fusion	80023 UN 01-G
Anesthesia device	Dräger	Titus
Arterial catheter Cavafix Certo	Braun, Melsungen, Germany	BRAU4152557
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL815
Calcium gluconate 10%	Braun, Melsungen, Germany	570/13596667/1214
Capnograph	Dräger	Scio
Cell saver	Medtronic	AutoLog
Centrifugal pump Biomedicus	Medtronic	85315 REV 3.0
Centrifuge Rotina 420R Hettich	VWR	521-1156
Custom made perfusion circuit	Medtronic	M323901C
Disposable set cell saver	Medtronic	ATLS24
DLP Single stage venous cannula, straight 20F	Medtronic	66120
Epoprostenol	GlaxoSmithKline Belgium, Wavre, Belgium	Flolan
Fentanyl-Janssen 0.05 mg/mL	Janssen	HK-08700
Flow sensor BioPro TT	Em-Tec	12271
Formaldehyde 4%	VWR	VWRK4078.9005
Freezer -80 °C	New Brunswick Scientific	U570-86
Fridge	Liebherr	CUP 3513
Geloplasma	Fresenius-Kabi, Bad Homburg, Germany	freeflex
Heater cooler	Stöckert-Shiley, Sorin group	16-02-1950
Heparin 5000 IE/mL	Leo Pharma, Ballerup, Denmark	HeparinLeo
Hepatic artery canula	Medtronic	BIO-MEDICUS 12F
IGL-1 organ preservation solution	Institut Georges Lopez	IGL-1/1000/D
In-line blood gas analyzer	TERUMO	Calibrator 3MCDI 540/CDI 500
Insulin 200 IU Actrapid	Novo Nordisk, Dagsvaerd, Denmark	MEDI-00018
Isoflurane 1000 mg/g Inhalation vapour	Chanelle Pharma	Iso-Vet
IV catheter BD Insyte-W 20 G	BD	381334
Liquid nitrogen tank	KGW Isotherm	S22
Mersilene 250CM M3 USP2/0 non needled ligapak	JNJ medical	F4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 non needled ligapak	JNJ medical	F4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 non needled	JNJ medical	EH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 non needled	JNJ medical	EH6734H
Micro pipettes 1000 µL	Socorex	82,51,000
Monitoring	Siemens	SC 8000
Plasmalyte Viaflo	Baxter	Plasmalyte Viaflo
Portal vein canula	CALMED LABS	18F RV-40018
Pressure sensor	Stöckert-Shiley, Sorin group	22-06-2000
Pressure servo regulator	Medtronic	BM 9505-2
Prolene 4-0	JNJ medical	EH7151H
Roller pump	Cobe Century USA	468048-000 REV C
Sodium bicarbonate 8.4%	Braun, Melsungen, Germany	362 2339
Sodium taurocholate	Sigma Aldrich, Burlington, USA	86339
Surgical scalpel nr 24	Swann Morton	0211
Venous catheter, 3-lumen; 12FR	ARROW	AK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 non needled gigapak	JNJ medical	V1205G
Xylazine 2%	VMD Livestock pharma	XYL-M 2%
Zinacef Cefuroxime 750 mg	GlaxoSmithKline Belgium, Wavre, Belgium	NDC 0173-0353-32
Zoletil 100	Virbac	Zoletil 100