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  • 参考文献
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摘要

在这里，我们提出了两种方案，用于在宏观尺度的水凝胶基质中嵌入无细胞蛋白质合成反应，而无需外部液相。

摘要

合成基因网络为科学家和工程师提供了一个平台，以设计和构建具有遗传水平编码功能的新系统。虽然部署基因网络的主要范式是在细胞底盘内，但合成基因网络也可以部署在无细胞环境中。无细胞基因网络的有前途的应用包括生物传感器，因为这些设备已被证明可对抗生物（埃博拉、寨卡和SARS-CoV-2病毒）和非生物（重金属、硫化物、杀虫剂和其他有机污染物）靶标。无孔系统通常以液体形式部署在反应容器内。然而，能够将这些反应嵌入物理基质中，可能有助于它们在更广泛的环境中得到更广泛的应用。为此，已经开发了在各种水凝胶基质中嵌入无细胞蛋白质合成（CFPS）反应的方法。有利于这项工作的水凝胶的关键特性之一是水凝胶材料的高水重构能力。此外，水凝胶具有对功能有益的物理和化学特性。水凝胶可以冷冻干燥以备后用，并重新水化以备后用。介绍了两种分步方案，用于在水凝胶中包含和测定CFPS反应。首先，CFPS系统可以通过细胞裂解物的再水化 掺 入水凝胶中。然后可以诱导或表达水凝胶内的系统，以便通过水凝胶完全表达蛋白质。其次，细胞裂解物可以在聚合点引入水凝胶中，整个系统可以在稍后点用含有水凝胶内编码的表达系统诱导剂的水溶液冷冻干燥和再水化。这些方法有可能允许无细胞基因网络，赋予水凝胶材料感官能力，并有可能在实验室之外部署。

引言

合成生物学整合了不同的工程学科，以设计和制造基于生物的部件、设备和系统，这些部件、设备和系统可以执行自然界中没有的功能。大多数合成生物学方法仍然与活细胞结合。相比之下，无细胞合成生物学系统促进了前所未有的控制和设计自由度，提高了工程生物系统的灵活性并缩短了时间，同时消除了传统基于细胞的基因表达方法的许多限制1,2,3。CFPS正被用于众多学科的越来越多的应用，包括构建人造细胞，原型遗传电路，开发生物传感器和生产代谢物4,5,6。CFPS对于生产在活细胞中不易表达的重组蛋白也特别有用，例如易聚集蛋白，跨膜蛋白和有毒蛋白6,7,8。

CFPS通常在液体反应中进行。然而，在某些情况下，这可能会限制它们的部署，因为任何无液体电池装置都必须包含在反应容器中。开发这里介绍的方法的基本原理是为将无细胞合成生物学设备嵌入水凝胶提供强大的方案，而不是作为蛋白质生产平台本身，而是允许使用水凝胶作为物理底盘，用于在实验室之外部署无细胞设备。使用水凝胶作为CFPS底盘有几个优点。水凝胶是聚合物材料，尽管含水量高（有时超过98%），但具有固体性质9,10,11。它们可用作糊剂、润滑剂和粘合剂，并存在于隐形眼镜、伤口敷料、海洋胶带、土壤改良剂和婴儿尿布9、11、12、13、14 等多种产品中。水凝胶作为药物输送载体也在积极研究9,15,16,17。水凝胶也可能具有生物相容性，可生物降解，并具有其自身的一些刺激反应9,18,19,20。因此，这里的目标是在分子生物学衍生的功能和材料科学之间创造协同作用。为此，已经努力将无细胞合成生物学与一系列材料相结合，包括胶原蛋白、拉蓬石、聚丙烯酰胺、纤维蛋白、PEG 肽和琼脂糖 11,21,22，以及涂覆玻璃、纸张和布的表面11,23,24与 CFPS 设备。这里介绍的方案展示了两种使用琼脂糖作为示例材料在宏观（即>1 mm）水凝胶基质中嵌入CFPS反应的方法。选择琼脂糖是因为其高吸水能力、受控的自凝胶性能和可调的机械性能 11,24,25,26。琼脂糖还支持功能性CFPS，比许多其他水凝胶替代品便宜，并且可生物降解，使其成为实验模型系统的有吸引力的选择。然而，这些方法先前已被证明适用于将CFPS嵌入一系列替代水凝胶中11。考虑到水凝胶的广泛应用和CFPS的功能，这里展示的方法可以为研究人员开发适合其自身目的的生物增强水凝胶材料提供基础。

在以前的研究中，尺寸范围为1μm至400μm的微凝胶系统已用于在浸没在反应缓冲液23,27,28,29,30,31中的水凝胶中进行CFPS。然而，将水凝胶浸没在CFPS反应缓冲液中的要求限制了它们本身作为材料部署的机会。此处介绍的方案允许CFPS反应在水凝胶内发生，而无需将凝胶浸没在反应缓冲液中。其次，使用宏观凝胶（尺寸在2毫米到10毫米之间）可以研究水凝胶与无细胞基因表达之间的物理相互作用。例如，使用该技术，可以研究水凝胶基质如何影响CFPS反应11以及CFPS反应如何影响水凝胶基质31。更大尺寸的水凝胶也允许开发新颖的生物可编程材料32。最后，通过将CFPS反应嵌入水凝胶中，还可以减少对塑料反应容器的需求。对于无电池传感器的部署，这比依赖塑料制品的设备具有明显的优势。综上所述，将CFPS反应嵌入水凝胶中为在实验室之外部署无细胞设备提供了几个优势。

这里介绍的方法的总体目标是允许在水凝胶基质内操作CFPS反应。在宏观尺度的水凝胶材料中嵌入无细胞蛋白质生产反应的两种不同方法得到了证明（图1）。在 方法A中，将CFPS组分引入冻干琼脂糖水凝胶中以形成活性系统。在 方法B中，熔融琼脂糖与CFPS反应组分混合以形成完整的CFPS水凝胶系统，然后将其冻干并储存直至需要。这些系统可以用一定体积的水或缓冲液和分析物再水化以开始反应。

这项研究使用基于 大肠杆菌 细胞裂解物的系统。这些是一些最受欢迎的实验性CFPS系统，因为 大肠杆菌 细胞裂解物制备简单，价格低廉，并且可以实现高蛋白质产量。细胞裂解物补充了进行转录和翻译所需的大分子组分，包括核糖体、tRNA、氨酰基-tRNA 合成酶以及起始、延伸和终止因子。具体而言，本文展示了使用 大肠杆菌 细胞裂解物在琼脂糖水凝胶中产生eGFP和mCherry，并使用酶标仪和共聚焦显微镜监测荧光的外观。微量滴定酶标仪的代表性结果可以在Whitfield等人31中看到，基础数据是公开的33。此外，使用共聚焦显微镜确认荧光蛋白在整个凝胶中的表达。本文中演示的两种协议允许在 材料中 组装和存储基于CFPS的遗传装置，最终目标是以支持现场部署的方式为无细胞基因电路的分布创造合适的物理环境。

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研究方案

1. 细胞裂解物缓冲液和培养基制备

  1. 制备2x YT+P琼脂和培养基
    1. 通过测量 16 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、5 g/L NaCl、40 mL/L 1 M K 2 HPO 4、22 mL/L 1 M KH2PO4 和 15 g/L 琼脂来制备 2x YT+P 琼脂。对于 2x YT+P 肉汤，遵循之前的成分，但省略琼脂。
    2. 通过高压灭菌 2x YT+P 进行灭菌。
  2. S30A缓冲液的制备
    1. 用 5.88 g/L 镁谷氨酸、12.195 g/L 钾谷氨酸和 25 mL/L 2 M Tris 制备 S30A 缓冲液，用乙酸调节至 pH 7.7。
    2. 将S30A缓冲液在4°C下储存长达1周。
  3. S30B缓冲液的制备
    1. 用 5.88 g/L 镁谷氨酸和 12.195 g/L K-谷氨酸制备 S30B 缓冲液，用 2 M Tris 调节至 pH 8.2。
    2. 将S30B缓冲液在4°C下储存长达1周。

2.细胞裂解物制备（4天方案）

  1. 第一天
    1. 将 2x YT+P 倒入补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的琼脂平板中。
    2. 从-80°C甘油原液中划出 大肠杆菌 ，并在37°C孵育过夜。
  2. 第二天
    1. 将 2x YT+P 平板中的单个菌落接种到 1 L 挡板烧瓶中的 400 mL 2x YT+P 肉汤（补充有氨苄青霉素）中。
    2. 在37°C下以220rpm振荡孵育24小时。
  3. 第三天
    1. 测量并记录24小时培养物的OD600 ;在OD600 为3-4时，生长就足够了。
      注意:取 1 mL 等分试样的细菌培养物，并在测量OD 600 nm 之前用培养基（2x YT + P 肉汤）进行连续稀释。在计算OD600时允许稀释效应。
    2. 在预冷的 500 mL 离心瓶之间均匀转移培养物。
    3. 在4°C下以4,500× g 离心15分钟，然后弃去上清液。
    4. 离心时，向先前制备的 S30A 缓冲液中加入 2 mL/L 的 1 M DTT，混合并保持缓冲液在冰上，完成 S30A 缓冲液制备。
    5. 将细胞沉淀重悬于 200 mL S30A 缓冲液中。
    6. 剧烈涡旋瓶子，直到整个颗粒完全溶解，尽可能将细胞保持在冰上。
    7. 在4°C下以4,500× g 离心15分钟，然后弃去上清液。
    8. 重复步骤 2.3.5-2.3.7（含）。
    9. 向每个离心瓶中加入 40 mL S30A 缓冲液，重悬沉淀，然后转移到预先称重的 50 mL 离心管中。
    10. 在4°C下以4,000× g 离心15分钟。 通过倾析丢弃上清液，并通过移液管除去残留的上清液，使其尽可能保持在冰上。
    11. 重新称量离心管，记录新质量，并计算颗粒的质量。
    12. 在液氮中快速冷冻颗粒，并将其储存在-80°C。
  4. 第四天
    1. 将颗粒在冰上解冻。
    2. 每 1 g 沉淀中加入以下内容:1.2 mL S30A 缓冲液（使用前添加 DTT）、275 μL 蛋白酶抑制剂（8 mM 储备液）和 25 μL 溶菌酶（10 mg/mL 储备液）。
    3. 剧烈涡旋，直到颗粒完全溶解，没有剩余的团块，尽可能将它们保持在冰上。
    4. 在 50 mL 离心管中，以 120 W、20 kHz、30% 振幅和 20 s/40 s 开/关脉冲超声处理细胞悬液，进行 5 分钟的超声处理。
    5. 在4°C下以4,000× g 离心1小时以沉淀细胞碎片。
    6. 将上清液转移到新鲜的 50 mL 离心管中。
    7. 将试管在37°C以220rpm孵育80分钟。
    8. 通过将 1 mL/L 的 1 M DTT 添加到 S30B 缓冲液中来制备透析材料。混合并将 900 mL 加入 1 L 无菌烧杯中。加入磁力搅拌器，并保持在4°C。
    9. 径流反应后，将步骤2.4.7中的细胞提取物转移到2mL微量离心管中，并在4°C下以20,000× g 离心10分钟。
    10. 将无沉淀上清液在 50 mL 离心管中的冰上合并。
    11. 确定产生的细胞提取物的总体积，并通过将它们浸入S30B中2分钟来水合必要数量的10K MWCO透析盒。
    12. 通过注射器 装入 最多 3 mL 提取物的盒式磁带。每1L烧杯透析至三个盒，在4°C下搅拌3小时。
    13. 透析完成后，澄清提取物，将提取物转移到2 mL微量离心管中。在4°C下以20,000× g 离心10分钟。
    14. 将澄清的提取物合并到冰上的新鲜离心管中，并短暂涡旋以混合。
    15. 使用荧光计测定提取物的蛋白质浓度。
    16. 使用预冷的 ddH2O 将提取物稀释至 44.5 mg/mL 的浓度。
    17. 等分试样成 200 μL 等分试样，在液氮中快速冷冻，并储存在 −80 °C。

3.冻干水凝胶的制备（方法A）

  1. 称取 0.75 g 琼脂糖，将 ddH2O 加入 100 mL 的体积，并在高温下微波 30 秒以产生熔融琼脂糖原液。
  2. 使用移液管将 50 μL 熔融琼脂糖转移到 1.5 mL 微量离心管中，并使凝胶聚合 20-30 分钟（如果将凝胶转移到冰箱中，聚合发生得更快）。
  3. 在液氮中快速冷冻含有聚合凝胶的微量离心管。
  4. 取下离心管的盖子，用蜡膜盖住离心管开口，并用针头或移液器尖端刺穿薄膜几次。
  5. 将含有聚合凝胶的微量离心管转移到-80°C储存1-2小时。
  6. 从-80°C储存中回收离心管，并放入冷冻干燥器中，确保管完全干燥。
  7. 使用以下设置接合冷冻干燥机:温度:−20 °C，压力:0.1 毫巴。
  8. 将凝胶冷冻干燥过夜。
  9. 从冷冻干燥器中回收凝胶，并将它们放入-80°C储存中，直到需要为止。
    注意:凝胶可以冷冻干燥保存长达 1 年。

4. 制备 14x 能量溶液储备液

  1. 将所有反应组分（表1）混合在冰上的15 mL离心管中，以产生14x能量溶液。
  2. 将 14x 能量溶液分装到 1.5 mL 微量离心管中，并储存在 −80 °C（可以使用较小体积的等分试样）。
    注意:如果避免反复冻融试管，14x能量溶液可以在-80°C下储存数月。

5. 4x氨基酸原液的制备

  1. 在冰上解冻RTS氨基酸采样器套件的所有20种氨基酸成分。涡旋氨基酸以确保它们完全溶解。
  2. 在 50 mL 离心管中，混合所有 20 种氨基酸，并加入 12 mL 无菌 ddH2O.涡旋直至溶液变得澄清，仅略带白色。
  3. 将 4x 氨基酸等分到 1.5 mL 微量离心管（500 μL 等分试样）中。
  4. 在液氮中快速冷冻4x氨基酸溶液等分试样，并将等分试样移至-80°C储存。

6. 无细胞缓冲液校准

注意:用于水凝胶反应的CFPS缓冲液按照Banks等人34 中的方案（从Sun等人35修改）校准为最佳DTT，Mg-谷氨酸和K-谷氨酸浓度。使用实验设计（DOE）方法选择校准反应组合物，选择七个因子水平:K-谷氨酸（200 mM，400 mM，600 mM，1,000 mM，1,200 mM，1,400 mM），Mg-谷氨酸（0 mM，10 mM，20 mM，30 mM，40 mM，50 mM，60 mM）和DTT（0 mM，5,10 mM，15 mM， 20 mM、25 mM、30 mM）库存。JMP Pro 15用于生成定制的DOE设计（表2），并进行分析以确定最佳因子浓度。

  1. 从-80°C储存中回收无细胞提取物，并在冰上解冻。
  2. 在冰上解冻 4x 氨基酸、14x 能量溶液、40% PEG-8000、质粒 DNA、3 M K-谷氨酸、100 mM 镁谷氨酸和 100 mM DTT 储备液。
  3. 通过混合 12.5 μL 的 4x 氨基酸、3.57 μL 的 14x 能量溶液、2.5 μL 的 40% PEG-8000、3 μg 质粒 DNA 和 10 μL 无细胞提取物 （44.5 mg/mL） 来创建校准预混液，并在 ddH2O 下每次反应最多补充 35 μL。
  4. 将 35 μL 预混液分配到黑色 384 孔微量滴定板的孔中。
  5. 按照DOE设计，向每个反应中加入适当体积的Mg-谷氨酸，K-谷氨酸和DTT，以及ddH2O，使每个反应高达50μL。
  6. 使用描述的酶标仪设置（对于mCherry）将微量滴定板转移到酶标仪上进行荧光检测和分析:激发:587 nm，发射:610 nm，波长带宽:12 nm，光学:顶部，温度:37°C，每5分钟收集一次荧光读数，总读取时间为4小时。在60rpm的脉冲设置下振荡孵育板。
  7. 将结果上传到JMP DOE设计中，并生成预测曲线，以根据所需的响应变量确定谷氨酸钾、谷氨酸镁和DTT的最佳浓度水平;在这种情况下，最大荧光和反应速率是响应变量。
  8. 如 表3 所示合并试剂以创建2X CFPS缓冲液
  9. 等分并储存在-80°C

7. 再水化冻干水凝胶中的CFPS（方法A）

注意:CFPS反应中使用的质粒是使用EcoFlex大 肠杆菌36 模块化工具包中的组分创建的，并在Whitfield等人11中描述，mCherry和eGFP在组成型JM23100启动子的控制下。这些组件可从Addgene获得。

  1. 从-80°C储存中回收无细胞提取物，并在冰上解冻约20分钟。
  2. 收集2x CFPS缓冲液和质粒DNA，并在冰上解冻。
  3. 收集冻干的水凝胶，并通过让凝胶站在工作台上使其达到室温15分钟。
  4. 将凝胶转移到 1.5 mL 微量离心管中，必要时用手术刀修剪凝胶，使其适合孔中。
  5. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 10 μL 无细胞提取物与 25 μL 2x CFPS 缓冲液和 4 μg 质粒 DNA 混合;用 ddH2O 弥补总体积为 50 μL 以创建 CFPS 溶液。
  6. 将CFPS溶液移液到冻干水凝胶上。
  7. 让凝胶在室温下浸泡在CFPS系统中5-10分钟。
  8. 使用刮刀将凝胶转移到黑色 384 孔微量滴定板上。
  9. 使用步骤6.6中描述的酶标仪设置将微量滴定板转移到酶标仪上进行荧光检测和分析。在以前的研究中可以获得代表性的结果31,33。

8. 可展开水凝胶中的无细胞蛋白质合成（方法B）

  1. 从-80°C储存中回收无细胞提取物，并在冰上解冻约20分钟。
  2. 收集质粒DNA，并在冰上解冻。
  3. 在冰上的 1.5 mL 微量离心管中，将 10 μL 无细胞提取物与 3 μg 质粒 DNA 和 25 μL 2x CFPS 缓冲液混合，总体积为 37.5 μL。
  4. 测量 3 g 琼脂糖，并加入 100 mL ddH2O 缓冲液中以产生 3% 琼脂糖。
  5. 微波30%琼脂糖在30秒内以高功率爆发。
  6. 将 12.5 μL 熔融琼脂糖移液到含有 CFPS 混合物的 1.5 mL 微量离心管中，总体积为 50 μL。
  7. 让熔融的琼脂糖冷却，但不聚合，将琼脂糖留在设置为50°C的加热块中。
  8. 将熔融琼脂糖与CFPS溶液混合;通过移液和吸头搅拌 进行 混合，并确保在混合CFPS溶液之前快速移动以避免凝胶聚合。
  9. 让凝胶在室温下冷却并聚合约2分钟。
  10. 用刮刀将聚合的琼脂糖转移到 1.5 mL 微量离心管中，并在液氮中快速冷冻。
  11. 将快速冷冻的水凝胶放入-80°C储存1小时。
  12. 从储存中回收凝胶;取下微量离心机管盖，用蜡膜覆盖管子，然后刺穿薄膜以使水分干燥。
  13. 使用以下设置接合冷冻干燥器:温度:-20°C，压力:0.1毫巴，冷冻干燥18小时（过夜）。
  14. 将冷冻干燥的CFPS设备储存在-80°C储存中直至使用。
  15. 冻干 CFPS 装置的湿体积约为 50 μL，可以用 50 μL ddH2O 进行再水化，而不会产生多余的液体。补液大约需要 30 分钟。
  16. 使用刮刀将凝胶转移到黑色 384 孔微量滴定板上。
  17. 使用步骤6.6中描述的酶标仪设置将微量滴定板转移到酶标仪上进行荧光检测和分析。代表性结果可在以前的出版物31,33中找到。

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结果

该协议详细介绍了将CFPS反应嵌入水凝胶基质中的两种方法， 图1 提供了两种方法的示意图。这两种方法都适合冷冻干燥和长期储存。方法A是最常用的方法，原因有两个。首先，它已被证明是处理一系列水凝胶材料的最适用方法11。其次，方法A允许对基因结构进行平行测试。方法B更适合于制造优化的系统和现场部署。两种方案都允许一次性制备多个样品，?...

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讨论

这里概述了将基于 大肠杆菌 细胞裂解物的CFPS反应掺入琼脂糖水凝胶的两种方案。这些方法允许在整个材料中同时表达基因。该方案可适用于其他CFPS系统，除了此处详述的实验室制备的细胞裂解物外，还已成功使用市售的CFPS试剂盒进行。重要的是，该方案允许在没有外部液相的情况下进行基因表达。这意味着该系统是独立的，不需要无细胞反应槽。与以前在水凝胶内发生CFPS反应的方法不?...

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披露声明

没有。

致谢

作者非常感谢生物技术和生物科学研究委员会奖BB/V017551/1（S.K.，T.P.H.）和BB/W01095X/1（A.L.，T.P.H.）以及工程和物理科学研究委员会-国防科学和技术实验室奖EP/N026683/1（C.J.W.，A.M.B.，T.P.H.）的支持。支持本出版物的数据可在以下网址公开获得:10.25405/data.ncl.22232452。出于开放获取的目的，作者已将知识共享署名（CC BY）许可应用于任何作者接受的手稿版本。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Amino Acid Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzyme A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamateSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit Protein concentration kitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifuge tubeSarstedt62.554.502
50 mL centrifuge bottlesSarstedt62.547.254
500 mL centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Benchtop CentrifugeThermo Fisher ScientificH-X3R
Black 384 well microtitre platesFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
High Speed CentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licenseSAS Institute15
Magnetic StirrerFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Photospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipettes and tipsGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Shaking IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Static IncubatorSanyoMIR-162
Syringe and needlesThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

参考文献

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