简化活体成像方法，用于在倒置共聚焦显微镜上长期监测上皮组织动力学

摘要

该协议提供了一种新工具，可使用倒置共聚焦显微镜简化活体成像。

摘要

了解正常和异常的 体内 细胞行为对于开发临床干预措施以阻止疾病的发生和进展是必要的。因此，优化成像方法至关重要，以促进原 位观察细胞动力学，其中组织结构和组成不受干扰。表皮是人体最外层的屏障，也是最普遍的人类癌症（即皮肤癌）的来源。皮肤组织的可及性为使用非侵入性活体显微镜监测完整动物的上皮和真皮细胞行为提供了独特的机会。然而，这种复杂的成像方法主要是使用正置多光子显微镜实现的，这对大多数研究人员来说是一个重要的进入壁垒。本研究提出了一种定制设计的 3D 打印显微镜载物台插件，适用于倒置共聚焦显微镜，简化了活转基因小鼠耳部皮肤的长期活体成像。我们相信，这项多功能发明可以定制以适应所选择的倒置显微镜品牌和型号，并适用于对其他器官系统进行成像，这将通过显着提高活体显微镜的可及性，为广大科学研究界证明是无价的。这种技术进步对于加强我们对正常和疾病背景下活细胞动力学的理解至关重要。

引言

活体显微镜是一种强大的工具，可以监测细胞在不受干扰的体内环境中的行为。这种独特的方法为复杂哺乳动物器官系统的内部运作提供了关键的见解，包括肺¹、大脑²、肝脏³、乳腺⁴、肠⁵ 和皮肤⁶。此外，这种方法还揭示了肿瘤发展过程中的细胞行为改变⁷、伤口愈合 ^8,9、炎症¹⁰ 和其他不同的原位病理。在这项研究中，我们专注于增强活体显微镜对完整小鼠皮肤中实时上皮和基质动力学成像的可及性。由于哺乳动物皮肤具有显着的再生和致瘤能力，了解哺乳动物皮肤中的细胞行为具有很高的临床意义。

小鼠的活体成像主要使用正置多光子显微镜进行，因为它们能够在组织深度 >100 μm^11,12 提供高分辨率成像。然而，这些仪器缺乏倒置共聚焦显微镜的主力多功能性和更普遍的可....

研究方案

这项研究是按照埃默里大学和亚特兰大退伍军人事务医疗中心的动物护理和使用指南进行的，并已获得机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 在倒置显微镜载物台上安装实时成像插件

1. 使用 .stl 文件（补充文件 1、补充文件 2 和补充文件 3）构建插入物，指定 3D 尺寸和设计（参见图 1 和图 2A）、3D 打印机和聚乳酸 （PLA）。
2. 小心地将插入物（图2B，C）放入大显微镜载物台凹槽（图2C和图3A）中。使用螺钉通过位于插入物每个角的四个螺丝孔固定插入物（图 2B-C）。
   注意：插入物是双向的，可以根据显微镜载物台和麻醉装置的方向旋转 180°。
3. 将加热板面朝下滑入插入插头（图 2D），使装置位于下....

讨论

在这项研究中，我们提出了一种新工具，该工具有助于在倒置共聚焦显微镜上对完整的小鼠皮肤上皮进行稳定、长期的活体成像。本发明由PLA制成，PLA是最常见和最便宜的3D打印材料;该插件的所有内部 3D 打印成本为 < 美元。两个独立的插入件（图 1、补充文件 1 和补充文件 2）可以使用固定螺钉轻松组装（参见 材料表）。值得注意的是?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging