简化活体成像方法，用于在倒置共聚焦显微镜上长期监测上皮组织动力学

摘要

该协议提供了一种新工具，可使用倒置共聚焦显微镜简化活体成像。

摘要

了解正常和异常的 体内 细胞行为对于开发临床干预措施以阻止疾病的发生和进展是必要的。因此，优化成像方法至关重要，以促进原 位观察细胞动力学，其中组织结构和组成不受干扰。表皮是人体最外层的屏障，也是最普遍的人类癌症（即皮肤癌）的来源。皮肤组织的可及性为使用非侵入性活体显微镜监测完整动物的上皮和真皮细胞行为提供了独特的机会。然而，这种复杂的成像方法主要是使用正置多光子显微镜实现的，这对大多数研究人员来说是一个重要的进入壁垒。本研究提出了一种定制设计的 3D 打印显微镜载物台插件，适用于倒置共聚焦显微镜，简化了活转基因小鼠耳部皮肤的长期活体成像。我们相信，这项多功能发明可以定制以适应所选择的倒置显微镜品牌和型号，并适用于对其他器官系统进行成像，这将通过显着提高活体显微镜的可及性，为广大科学研究界证明是无价的。这种技术进步对于加强我们对正常和疾病背景下活细胞动力学的理解至关重要。

引言

活体显微镜是一种强大的工具，可以监测细胞在不受干扰的体内环境中的行为。这种独特的方法为复杂哺乳动物器官系统的内部运作提供了关键的见解，包括肺¹、大脑²、肝脏³、乳腺⁴、肠⁵ 和皮肤⁶。此外，这种方法还揭示了肿瘤发展过程中的细胞行为改变⁷、伤口愈合 ^8,9、炎症¹⁰ 和其他不同的原位病理。在这项研究中，我们专注于增强活体显微镜对完整小鼠皮肤中实时上皮和基质动力学成像的可及性。由于哺乳动物皮肤具有显着的再生和致瘤能力，了解哺乳动物皮肤中的细胞行为具有很高的临床意义。

小鼠的活体成像主要使用正置多光子显微镜进行，因为它们能够在组织深度 >100 μm^11,12 提供高分辨率成像。然而，这些仪器缺乏倒置共聚焦显微镜的主力多功能性和更普遍的可及性，后者更人性化、更具成本效益，能够对培养的细胞进行成像，在图像采集过程中不需要完全黑暗，并且通常更安全，以及其他显着优势^13,14.在这项研究中，我们提出了一种新工具，通过将这种方法应用于倒置共聚焦显微镜，显着提高了活体成像的可及性。

在这里，我们展示了一种 3D 打印的定制载物台插入设计，该设计结合了几个关键功能，以促进在倒置共聚焦显微镜上对小鼠耳部皮肤进行稳定、长期的活体成像（图 1、图 2、图 3、图 4 和图 5）。这些特殊功能包括一个偏移物镜孔，允许成年小鼠的整个身体在成像过程中完全平放。这最大限度地减少了小鼠身体运动对成像的振动干扰，并且无需使用氯胺酮和甲苯噻嗪来抑制呼吸，这种做法通常与活^{体成像相结合}6。此外，插入物上的角支架可正确定位异氟醚鼻锥以与鼠标正面对齐，金属耳夹将鼠标耳朵固定在定制的盖玻片上，可选的可拆卸闭环生物反馈加热板齐平放置在插入物内，以在长时间成像期间支持小鼠体温。定制的盖玻片盘为小鼠头部和耳朵平放提供了必要的平坦表面，它是在机械车间通过去除含有通用盖玻片的细胞培养皿的壁而产生的。将 40 倍硅油浸没透镜（1.25 数值孔径 [N.A.]，0.3 mm 工作距离）与盖玻片和定制载物台插件结合使用，可提供深入耳真皮> 50 μm 的高分辨率图像。

为了测试这种新的倒置显微镜载物台插入物的功能，我们在活的转基因K14-H2B-mCherry¹⁵成年小鼠的耳朵中捕获了跨越所有表皮上皮层的z-stacks（该小鼠系中的上皮细胞核含有红色荧光标记）（图6A-A'）。我们还在活转基因 Pdgfra-rtTA¹⁶ 的耳朵中捕获了 3 小时内跨越皮肤真皮内多个成纤维细胞层的 z 堆栈;pTRE-H 2 B - GFP¹⁷成年小鼠（该小鼠系中的成纤维细胞核在多西环素诱导后含有绿色荧光标记）（图6B-D'）。我们的高分辨率数据显示，由于 x、y 和 z 平面没有漂移，因此具有一致的稳定性，从而证明了这种新型活体成像工具在倒置显微镜上使用的有效性。重要的是，这种3D打印载物台插件的尺寸可以调整，如补充文件1、补充文件2和补充文件3中所述，以适应任何倒置显微镜，并且物镜开口的位置可以移动到插件内的其他位置，以更好地适应感兴趣的特定组织和/或动物模型的成像。因此，这项发明可以使单个实验室或具有核心设施共聚焦访问能力的研究人员能够根据其独特的活体成像需求调整该工具，从而简化对各种体内细胞生物学的评估。

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研究方案

这项研究是按照埃默里大学和亚特兰大退伍军人事务医疗中心的动物护理和使用指南进行的，并已获得机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 在倒置显微镜载物台上安装实时成像插件

1. 使用 .stl 文件（补充文件 1、补充文件 2 和补充文件 3）构建插入物，指定 3D 尺寸和设计（参见图 1 和图 2A）、3D 打印机和聚乳酸 （PLA）。
2. 小心地将插入物（图2B，C）放入大显微镜载物台凹槽（图2C和图3A）中。使用螺钉通过位于插入物每个角的四个螺丝孔固定插入物（图 2B-C）。
   注意：插入物是双向的，可以根据显微镜载物台和麻醉装置的方向旋转 180°。
3. 将加热板面朝下滑入插入插头（图 2D），使装置位于下部插入槽的顶部，插头端口穿过舞台下方（图 3B）。
4. 将插入物中的凹槽圆形开口与40倍硅油浸没物镜对齐（图3C），并将硅油涂在物镜的中心。
   1. 如果成像时间较长（>1 小时），则在整个成像过程中，涂抹大量油，该油将持续存在于盖玻片/物镜界面处。不要让油溢出镜头的边缘。
5. 使用注射器沿带槽的圆形开口涂抹少量真空润滑脂，并将盖玻片放在顶部以密封在插入物上（图3D）。
   注意：盖玻片是通过去除35 mm x 10 mm玻璃底细胞培养皿（由机械车间执行）的壁来创建的。
6. 抬起 40 倍物镜，直到油亲吻玻璃盖玻片底部。

2. 异氟醚构型和小鼠制备

1. 放置低流量电子汽化器组件（麻醉室，管道，汽化器，木炭罐），以使鼻锥和连接的管道到达插入物（图3A）。
   注意：异氟醚是一种吸入麻醉剂，应小心处理，以避免溢出并尽量减少人体接触。
2. 使用前测量异氟醚瓶的重量并记录。将电子蒸发器的盖子连接到异氟烷瓶上。
3. 将电源线连接到电子蒸发器。关闭蓝色鼻锥夹并打开白色感应室夹，让气流通过腔室进入木炭罐。从机器左侧取下红色环境空气帽，让空气流通。
4. 让系统以 200 mL/min（低流量）和 2% 异氟醚预热 5 分钟。
   注意： 虽然选择了鼻锥设置，但蓝色鼻锥线应保持关闭状态，白色感应室线应保持打开状态。
5. 一旦系统正确平衡，吹扫管路以从腔室中除去剩余的异氟烷。
6. 将鼠标放入感应室并选择高流量。在将动物的身体放在插入物上之前，完成所有小鼠准备工作（即脱毛、局部给药、眼药膏应用等）。使用脚趾捏反射法确认鼠标已完全麻醉。
   1. 腿部伸展，用指甲用力捏住脚趾，而不会造成物理伤害。如果小鼠对刺激表现出积极反应（即腿部缩回、脚抽搐等），则继续在腔室内施用麻醉剂，直到没有观察到任何反应。一旦适当麻醉，小鼠呼吸频率应减慢至每分钟~55-65次呼吸¹⁸。
7. 当鼠标完全麻醉后，再次选择高流量以停止异氟烷输送。在打开之前吹扫腔室并调整夹子（蓝色：打开;白色：关闭）以通过鼻锥输送异氟醚。当鼻锥连接到鼠标时选择低流量以继续异氟醚输送。
8. 将带有连接的鼻锥的异氟醚管穿过插入物上的角管支架（图3A 和 图5）。

3. 将鼠标放置在插入物上以进行活体成像

1. 将加热板插入控制器（包含连接的肛门探头），打开电源，让加热板达到36°C（图4A）。
2. 将麻醉的小鼠从诱导室中取出并放在加热板上（图4B 和 图5A）。快速执行从腔室到插入物的转移，以最大限度地减少小鼠在没有吸入麻醉的情况下活动的时间。
3. 将鼻锥固定在鼠标上（图 4B、C 和 图 5）。如有必要，使用胶带进一步固定鼻锥的角度和位置。
4. 插入肛门探头并调节控制器温度，直到小鼠体温稳定在~36°C（图4A，B）。鼠标正确放置后，如果需要，使用塑料保鲜膜吸收热量，以进一步支持适当的体温（图4C）。
5. 放置鼠标，使头部与盖玻片对齐，并使用金属耳夹（图5A，B）或胶带（图5C）将耳朵固定在玻璃盖玻片的中心。
   注意： 可以通过松开将夹子固定到插件上的螺钉来调节金属耳夹在耳朵上的压力。可以添加金属弹簧以增加夹子拧紧的灵活性。
   1. 要更改耳夹位置，请用 2.5 毫米内六角扳手拧下螺栓并转移到辅助部位（图 2B、C）。重新组装耳夹时，将耳夹靠在插入物上，然后将垫圈放在顶部。使用螺栓用力牢固地固定夹子，以旋转夹子。
6. 调整物镜z定位，直到细胞位于焦点位置（图6A，D）。根据实验目标设置z-stack和延时参数，开始图像采集。
   注意：如果实现正确的设置，则可以对小鼠耳朵进行至少连续3小时的成像（图6A'，D'）。
   1. 设置z堆栈边界后，调整激光功率和增益，以确保没有z平面过饱和，以最大程度地减少光漂白。使用 z 堆栈的总厚度、步长数（建议使用奈奎斯特采样）和时间间隔确定延时参数。
   2. 使用多种因素确定成像参数（时间间隔、总成像时间等），包括麻醉下的动物活力、激光诱导的光漂白/光毒性以及活体成像的目标（即细胞分裂动力学、细胞间相互作用等）。

4. 成像终止

1. 打开水循环加热垫，设置为 连续循环 和 35 °C 至少 30 分钟，然后终止图像采集。
2. 成像完成后，在电子蒸发器上选择 低流量 以停止异氟醚输送并将鼠标移动到加热垫上，直到可以走动。
3. 唤醒后，将鼠标移回转移容器，同时继续保持在加热垫上，直到完全可以走动。在加热垫上持续监视鼠标，直到它响应。
4. 在电子蒸发器上，单击 “选择菜单”>“麻醉控制”>“清空”。从系统中取出异氟醚瓶，然后将制造商的瓶盖放回瓶子上。
5. 测量异氟烷瓶和木炭罐的重量，并将重量输入日志。一旦木炭罐的重量超过基线测量值 50 克，请处理罐并更换新装置。将异氟醚放回密码箱。
6. 取下盖玻片，用镜头纸和镜头溶液擦拭干净。妥善存放以避免划伤以备重复使用。
7. 从插入支架上取下麻醉管，然后从显微镜载物台上拧下插入物。

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结果

通过在≥1小时的时间过程中获取荧光标记的活耳组织的z堆栈来验证在倒置共聚焦显微镜上正确组装活成像插入物以及转基因小鼠在插入物顶部的适当方向，并且在x轴，y轴和z轴上漂移的证据最小。图像应以一致的间隔捕获（间隔时间将取决于生物学问题、荧光信号的强度等），以便可以随时间跟踪细胞动力学和图像漂移。在整个时间过程中，监测单个 z 平面以确保它们保持焦点，揭示动物运动?...

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讨论

在这项研究中，我们提出了一种新工具，该工具有助于在倒置共聚焦显微镜上对完整的小鼠皮肤上皮进行稳定、长期的活体成像。本发明由PLA制成，PLA是最常见和最便宜的3D打印材料;该插件的所有内部 3D 打印成本为 < 美元。两个独立的插入件（图 1、补充文件 1 和补充文件 2）可以使用固定螺钉轻松组装（参见 材料表）。值得注意的是?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging