玻璃体和房水标本的游离 DNA 提取用于玻璃体视网膜淋巴瘤的诊断和监测

摘要

本文建立了一种从玻璃体和房水中提取游离 DNA 以进行分子研究以诊断玻璃体视网膜淋巴瘤的程序。该方法能够同时从样品的细胞成分中提取 DNA 或将其保留用于辅助测试。

摘要

玻璃体视网膜淋巴瘤 （VRL） 是一种侵袭性淋巴瘤，通常被归类为原发性中枢神经系统弥漫性大 B 细胞淋巴瘤。为了诊断VRL，需要收集玻璃体液和最近的房水等标本。对这些标本进行 VRL 的诊断测试包括细胞学、流式细胞术和分子检测。然而，细胞病理学和流式细胞术，以及使用细胞DNA的分子检测，都需要完整的全细胞。挑战在于玻璃体和房水通常具有低细胞性，并且许多细胞在收集、储存和处理过程中被破坏。此外，由于玻璃体液粘度高，玻璃体液和房水体积小，这些标本给分子检测带来了额外的困难。本研究提出了一种从玻璃体和水性标本中提取游离DNA的方法。这种方法补充了细胞DNA的提取，或允许这些标本的细胞成分用于其他诊断方法，包括细胞学和流式细胞术。

引言

玻璃体视网膜淋巴瘤 （VRL） 是一种与原发性中枢神经系统弥漫性大 B 细胞淋巴瘤相关的侵袭性淋巴瘤 ^1,2,3。VRL通常是致命的，因为它受累于中枢神经系统^1,2。虽然罕见^1,4，但 VRL 通常表现为类似于后葡萄膜炎和其他玻璃体视网膜疾病的症状 ^4,5。因此，出现葡萄膜炎症状的患者需要诊断以确认或排除 VRL。

最近，发布了诊断 VRL 的共识标准，其中包括临床检查和实验室检查结果的结合⁶。通常用于诊断 VRL 的标本包括玻璃体液和最近的房水⁷。玻璃体液是通过称为扁平玻璃体切除术的外科手术获得的，该手术允许进入眼睛的后段⁸.

在所提出的方案中，....

研究方案

本协议遵循人类护理指南，并经密歇根大学机构审查委员会 （IRB） 批准。为此，IRB获得了知情同意的豁免。对于所涉及的患者，没有相关的纳入或排除标准。

1. 细胞和无细胞成分的分离

注意：可以接收三种类型的样本进行 VRL 诊断测试：玻璃体（未稀释;在开始输注前收集的玻璃体切除术液体）、盒袋内稀释的玻璃体（图 1）和房水（来自眼睛前房的液体）。

1. 对于非常粘稠的未稀释玻璃体液，用 3-5 mL PBS 稀释以方便移液。
2. 对于盒袋内的稀玻璃体（补充图1），将液体排入50 mL锥形管中（每45 mL液体一个）。
3. 房水的体积非常低 （<200 μL）。为确保细胞的最大回收率，将样品转移到 1.5 mL 管中，用等体积的 PBS 冲洗收集样品的原始 500 μL 微量离心管，然后加入 1.5 mL 管中。
4. 在室温下以3,000× g 离心玻璃体或水溶液15分钟。
5. 使用移液管小心地除去上清液，注意不要干扰沉淀细胞。

2. 从细胞成分中提取 DNA

1. 加入适量的细胞裂解液（小....

讨论

玻璃体视网膜淋巴瘤 （VRL） 是一种侵袭性大 B 细胞淋巴瘤 ^1,2,3，^其症状可以模仿其他玻璃体视网膜疾病 ^4,5。玻璃体和最近的房水分子检测已成为诊断或排除 VRL 的关键方法。然而，这些液体的体积非常小，并且通常具有低细胞性。这些液体中的许多细胞也可能在收集、储存和处理?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010