小鼠附睾脂肪组织中间充质干细胞的分离、体外扩增和表征

摘要

脂肪组织是间充质干细胞的极好来源。在这里，我们带来了从瑞士小鼠附睾脂肪组织中逐步提取、培养和表征脂肪组织衍生干细胞 （ADSC） 的过程。

摘要

间充质干细胞 （MSCs） 作为一种新的治疗方法已被广泛研究，主要用于阻止炎症加剧，因为它们具有调节免疫反应的潜力。间充质干细胞是一种免疫特权细胞，能够在免疫互容的同种异体移植受者中存活，这些受体基于 I 类主要组织相容性复合物 （MHC） 分子的低表达以及使用基于细胞的疗法进行同种异体移植。这些细胞可以从多种组织中分离出来，最常用的是骨髓和脂肪组织。我们提供了一种简单的方案来分离、培养和表征小鼠附睾脂肪组织中的 MSC。附睾脂肪组织通过手术切除，物理破碎，并用 0.15% II 型胶原酶溶液消化。然后，在 体外培养和扩增原代脂肪组织来源的干细胞（ADSC）细胞，并通过流式细胞术进行表型表征。我们还提供了将ADSC分化为成骨细胞、产脂细胞和软骨生成细胞的步骤，然后对每个细胞谱系进行功能表征。此处提供的方案可用于 体内 和 离体 实验，作为替代方案，脂肪来源的干细胞可用于产生MSCs样永生化细胞。

引言

间充质干细胞 （MSC） 是分化成成骨细胞、软骨母细胞和脂肪细胞等细胞的成体多潜能细胞 ^1,2。这些细胞存在于多个器官中，因此，它们可以从骨髓、肌肉、脂肪、毛囊、牙根、胎盘、真皮、软骨膜、脐带、肺、肝脏和脾脏等成人组织中提取 ^3,4。

间充质干细胞对生理学和免疫系统的影响已有报道 ^5,6。这些细胞在人类和兽医学中都有望治疗多种疾病。间充质干细胞可以通过不同的机制控制炎症并促进血管生成和组织稳态，例如细胞间接触、可溶性因子和小细胞外囊泡 7,8,9,10。此外，间充质干细胞是免疫特权细胞，能够在免疫不相容的同种异体移植受体中存活，因为这些细胞显示出 I 类主要组织相容性复合体 （MHC） 分子的低表达，并且用于基于细胞的同种异体移植疗法^11,12。低免疫原性与再生潜力相结合，使间充质干细胞成为细胞疗法的理想候选药物，例如移植物抗宿主病 （GvHD）¹³、系统性红斑狼疮 （SLE）¹⁴ 和多发性硬化症¹⁵ 等^16,17。

尽管间充质干细胞存在于几种成体组织中，但脂肪组织比其他来源具有优势，例如易于收获，手术干预最少;可用电池数量多，扩增率高;使用易于执行的方案轻松进行体外扩增，无需特定设备和低成本材料 18,19,20。一旦提取，脂肪组织来源的干细胞 （ADSC） 必须按照国际细胞治疗学会 （ISCT） ²¹ 的规定进行表征。因此，间充质干细胞必须表现出形态成纤维细胞样，对塑料培养物的粘附，表达高百分比 （≥95%） 的间充质标志物，如内分泌素 （CD105）、胞外-5'-核苷酸酶 （CD73） 和 Thy-1 （CD90），以及低百分比 （≤2%） 的造血标志物，如白细胞共同抗原 （CD45）、跨膜磷酸糖蛋白 （CD34）、糖脂锚定膜糖蛋白 （CD14）、整合素 α M （CD11b）、B 细胞抗原受体复合物相关蛋白 α 链 （CD79α） 或B 淋巴细胞表面抗原 B4 （CD19） 和 II 类人类白细胞抗原 （HLA-II）。此外，还需要进行功能表征，并且细胞应该能够分化为成骨细胞、软骨母细胞或脂肪母细胞²¹。

在这里，我们展示了如何使用机械解离和酶消化从附睾脂肪组织获得MSCs，用于 体外 研究以及ISCT预先确定的形态学表征。

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研究方案

所有动物实验均根据国际动物伦理准则进行，并由圣克鲁斯州立大学护理和使用机构委员会根据协议编号021/22批准。瑞士雄性小鼠（6-8周）购自动物育种，维护和实验实验室 - 圣克鲁斯州立大学（LaBIO-UESC）动物研究设施，维持在特定的无病原体条件下，自由接受水和食物，12小时光/暗循环。

注意:可以使用其他小鼠谱系;我们建议使用成年小鼠（6-8周），因为它们具有更发达的脂肪组织和具有高增殖活性的细胞。

1. 准备工作

注意:在继续之前，请准备以下所述的试剂。有关试剂和材料供应商信息，请参阅 材料表 。在所有实际程序中都必须佩戴个人防护设备，例如口罩、帽子、实验室外套和手套。

1. 附睾脂肪组织摘除术
   1. 预留手术材料:三套无菌镊子和剪刀、五根针头和一个装有 200 mL 70% 乙醇的烧杯。
   2. 准备终末麻醉剂，混合氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）。
2. ADSCs文化
   1. 基础培养基:制备补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、50 μg/mL 庆大霉素、0.25 μg/mL 两性霉素 B、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 高葡萄糖培养基。
   2. 消化溶液:在0.25μm过滤器中灭菌的PBS中制备0.15%的II型胶原酶。
      注意:没有必要使用基础培养基中描述的四种抗生素。这将取决于进行此操作的实验室的细胞培养条件。
3. ADSCs表型表征
   1. 在PBS中制备1%牛血清白蛋白（BSA）。
   2. 稀释表 1中提到的抗小鼠抗体。
   3. 在PBS中制备2%的甲醛。
4. ADSCs成骨分化
   1. 成骨分化培养基:制备补充有 5.67 M 抗坏血酸、10 nM 地塞米松、0.02 M β-甘油磷酸盐、10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM。
   2. 对于 Von Kossa 染色，制备以下溶液:70% 乙醇水溶液、5% 硝酸银水溶液、蒸馏水、5% 硫代硫酸钠水溶液和 1% 曙红 B 水溶液。
5. 成脂分化:
   1. 成脂分化培养基:制备补充有0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，200μM吲哚美辛，1μM地塞米松，10μM胰岛素，10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM。
   2. 对于油红染色，制备以下溶液:10%福尔马林在去离子水中，60%异丙醇在去离子水中，溶血色素（脂溶性染料）重氮染料（油红O溶液）在60%异丙醇中，和1%苏木精在去离子水中。
6. 软骨分化:
   1. 软骨分化培养基:制备补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的软骨形成培养基。
   2. 在PBS中制备10%的甲醛。
   3. 对于蛋白聚糖和糖胺聚糖染色，制备以下溶液:杂聚糖染色剂（阿尔新蓝 1%）在乙酸、pH 2.5、石蜡、苏木精、乙醇系列水中稀释（100%、96%、80% 和 70%）。

抗体/荧光基团	稀释	克隆	终浓度 （μg/mL）	表达它的函数和细胞
CD34-聚乙烯	1:100	内存34	2	细胞粘附因子。造血干细胞。
CD45-装甲运载火箭	1:100	30-F11型	2	协助激活白细胞。在白细胞中表达。
CD71-异硫氰酸荧光素	1:100	C2型	5	控制细胞增殖过程中的铁摄取。增殖细胞、网织红细胞和前体细胞。
CD29-异硫氰酸荧光素	1:100	公顷2/5	5	粘附和活化、胚胎发生、白细胞、树突状细胞、血小板、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞。
CD90-PerCP	1:100	OX-7 （氧-7）	2	信号，粘附。T淋巴细胞、NK、单核细胞、造血干细胞、神经元和成纤维细胞。

表 1:用于通过流式细胞仪对 ADSC 进行表型表征的抗体。 抗体列表，包括它们各自的荧光染料、稀释度、克隆和终浓度，以及它们在表达的细胞中的功能。

2. 方法

注意:脂肪组织分布在全身皮下或腹腔内位置。在小鼠中，用于实验的最常见脂肪组织包括皮下附睾、肠系膜和腹膜后²²。这里显示了获得附睾脂肪组织的步骤（图1）。

图 1:从瑞士小鼠获得脂肪组织来源的干细胞的实验设计。 （A） 用针头将动物放在软木塞或聚苯乙烯泡沫塑料板上;（B） 用镊子提起皮肤，在腹部中央切开一个切口，然后将皮肤从腹膜上分离;（三）识别附睾上方的白色脂肪组织;（D）将组织转移到补充有10%FBS和1%抗生素的DMEM培养基中，用PBS彻底洗涤附睾脂肪组织，并将组织转移到消化液中;（E），将组织碎片和（F）在37°C下孵育1小时，每10分钟剧烈摇动一次;（G）计数细胞后，将板置于6孔板中，并在倒置显微镜下观察细胞形态。（F） 细胞形态将从圆形变为成纤维细胞样。比例尺 = 22.22 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

1. 附睾脂肪组织摘除术
   注意:请注意，所有程序都必须在无菌条件下在层流柜中进行，以确保纯净和无污染的细胞培养。
   1. 通过腹膜内途径使用氯胺酮和甲苯噻嗪溶液（100和10mg / kg，如步骤1.1.2所述）对动物实施安乐死。
      注意:可以使用其他安乐死方法²³.通过确认没有心跳来确保动物已经死亡。
   2. 将动物腹侧朝上放在覆盖有铝箔的软木或聚苯乙烯泡沫塑料板上，并使用无菌针头固定（图1A）。
      注意:为避免污染，请在腹部区域喷洒 70% 的酒精。或者，用手术刀剃掉头发。
   3. 用镊子在腹部区域中央提起皮肤，然后用无菌剪刀剪开。
      注意: 为避免污染，需要两套无菌镊子和剪刀。第一种用于打开动物，切开皮肤和腹膜层;第二个用于拾取附睾脂肪组织。此外，在烧杯中保留 150 mL 70% 酒精，以便在两步之间清洁剪刀和镊子。
   4. 将剪刀插入动物的皮肤下，然后打开它以将其与腹膜分离（图1B）。用镊子提起腹膜层，并用无菌剪刀剪开。
   5. 使用另一套无菌镊子和剪刀，识别睾丸上方的附睾和附睾上方的白色脂肪组织。使用约2厘米大小的无菌镊子拉动整个附睾脂肪组织，并在非常靠近附睾的地方切开（图1C）。
   6. 将脂肪放入含有基础培养基的50mL无菌锥形管中，并将其置于冰上（图1D）。在引擎盖中，继续执行下面所述的后续步骤。
2. 脂肪组织来源的干细胞 （ADSC） 分离
   注意:在生物 II 类层流罩中处理样品，人员应穿实验室外套、手套和外科口罩。
   1. 用PBS彻底清洗附睾脂肪组织。
      注意:此步骤对于从样本中去除血液和其他颗粒至关重要。血液会抑制II型胶原酶并损害实验。
   2. 使用无菌镊子，将附睾脂肪组织转移到含有 15-20 mL 消化溶液的 50 mL 管中，按步骤 1.2.2 制备。使用无菌剪刀将组织切碎，并将组织在37°C孵育1小时（图1E，F）。
      注意:此步骤可以使用37°C的水浴或培养箱。每 10 分钟，必须剧烈摇晃悬浮液以促进消化。不要延长1小时的孵育时间。
   3. 通过在基础培养基中1:1稀释样品来灭活胶原酶，并在4°C下以250× g 离心悬浮液10分钟以获得基质的维管部分。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 基础培养基中。
   4. 在Neubauer室中使用1:10或1:100的稀释度，通过台盼蓝染料排除法检查细胞活力并计数细胞。
      注:预期产量约为 0.5-100 万个细胞/g 处理过的脂肪组织，活力为 80%。
   5. 将分离的细胞（0.3-50 万）接种在 6 孔板的一个孔中的 3 mL 基础培养基中。将细胞在37°C与5%CO₂孵育过夜。
   6. 第二天:从孔中取出培养基，用PBS洗涤细胞。加入 3 mL 基础培养基。每 2 天重复一次此过程，直到细胞达到 90% 汇合。
      注意:始终在倒置显微镜下观察细胞的形态，从圆形变为成纤维细胞样（图1H）。
3. 脂肪组织来源的干细胞 （ADSC） 扩增
   注意:一旦细胞生长~90%汇合，就按照下述方式进行传代培养。
   1. 从孔中取出培养基，用PBS洗涤细胞。加入0.5mL /孔的胰蛋白酶/ EDTA（0.05%胰蛋白酶;200mg / L EDTA），并在37°C下孵育板3-5分钟以分离细胞。
      注意:在胰蛋白酶/EDTA 中不要超过 5 分钟。细胞的完全脱离应在倒置显微镜下验证。可以通过小心地上下移液或轻敲板的侧面来加速该过程。
   2. 通过在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 抗生素的 DMEM 中以 1:1 的比例稀释样品来灭活酶。
   3. 将细胞悬液分成 2 个孔，加入 3 mL 基础培养基（DMEM，补充有 10% FBS 和 1% 抗生素）。在37°C下用5%CO₂孵育过夜。
   4. 第二天更换培养基，然后每 2 天更换一次，直到汇合度达到 90%。
   5. 重复该过程直到第三次传代，然后进行表型和功能表征。
      注意:始终在倒置显微镜下观察细胞的形态，从圆形变为成纤维细胞状。
4. 脂肪组织来源的干细胞 （ADSC） 表征
   1. 通过流式细胞术进行表型表征
      1. 使用胰蛋白酶/EDTA 分离细胞，如步骤 2.3.1 至 2.3.2 中所述。
      2. 将细胞收集在锥形管（50mL）中，并在4°C下以250× g 离心10分钟。 弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
      3. 如步骤 2.2.4 中所述计数细胞，并在 96 孔板中的 100 μL PBS 中接种 0.5-1 x^{10 6} 个细胞。
         注意:孔的数量将取决于荧光染料偶联物的颜色和细胞仪的滤光片/激光器。
      4. 加入在PBS中的1%BSA稀释的抗体（表1）。
         注意:没有必要使用 Fc 阻滞剂来避免非特异性结合，因为我们已经使用 BSA 来稀释抗体。保留一个未接收抗体的细胞样本，这些抗体将用作染色对照。根据实验室中可用的荧光染料和细胞仪，抗体可以在同一孔中结合。 表 1 中描述的所有抗体都可以在同一孔中添加，但 CD71 FITC 和 CD29 FITC 除外，由于荧光染料相同，它们必须在不同的孔中。
      5. 将板在4°C下在黑暗中孵育30分钟。
      6. 洗涤细胞，然后使用PBS完成体积至200μL，在4°C下以252× g 离心板10分钟，并弃去上清液。再次重复此步骤。
      7. 通过在 PBS 中每孔加入 200 μL 2% 甲醛来固定细胞。将细胞储存在4°C的黑暗中，直到在流式细胞仪中进行分析。
         注意:为获得最佳结果，请尽快在流式细胞仪上采集细胞。对于大多数荧光染料，标记物的荧光亮度在48小时后显着衰减。因此，不要超过 48 小时来读取板。建议采集 30,000 个事件。
      8. 使用 图 2B 中所示的门控策略来选择 ASC 群体。
   2. 功能表征:成骨分化
      1. 使用胰蛋白酶/ EDTA分离细胞（如步骤2.3.1至2.3.2中所述），收集并离心细胞（如步骤2.4.1.2和2.4.1.2中所述），并计数它们（如步骤2.2.4中所述）。
      2. 板，一式三份，每孔 2 x 10⁵ 个细胞，位于基底内侧的 6 孔板中（DMEM 补充有 10% FBS 和 1% 抗生素）;在37°C的5%CO₂中孵育。
         注意:需要两个 6 孔板，每个分化时间（14 天和 21 天）一个。
      3. 第二天，将培养基更换为成骨培养基（步骤1.4.1）。
         注意:保留 3 个孔仅用基础培养基培养，这将是分化的对照。
      4. 在成骨培养基和对照细胞中培养细胞 14 天和 21 天，每 3 天更换一次培养基。继续进行Von Kossa染色（步骤1.4.2）以评估每个培养期结束时的矿化结瘤。
      5. 从每个孔中吸出培养基，并用PBS洗涤细胞两次。在室温 （RT） 下用 2 mL 70% 乙醇固定细胞过夜。在流水中小心清洗细胞。
      6. 加入 2 mL 5% 硝酸银溶液，并将板在紫外线下孵育 1 小时。用蒸馏水清洗细胞。加入 2 mL 5% 硫代硫酸钠，孵育 5 分钟。用蒸馏水清洗。
      7. 用 2 mL 曙红复染 40 秒。用蒸馏水洗涤，直到去除染色溶液，并使用光学显微镜观察染色。
   3. 功能表征:成脂分化
      1. 使用胰蛋白酶/ EDTA分离细胞（如步骤2.3.1至2.3.2中所述），收集并离心细胞（如步骤2.4.1.2和2.4.1.2中所述），并计数它们（如步骤2.2.4中所述）。
      2. 在基底内侧的 6 孔板中每孔板 2 x 10⁵ 个细胞（DMEM 补充有 10% FBS 和 1% 抗生素）;在37°C的5%CO₂中孵育。
         注意:需要两个 6 孔板，每个分化时间（14 天和 21 天）一个。
      3. 第二天，将培养基更换为脂肪生成培养基（步骤2.5.1）。
         注意:保留 3 个孔，仅使用基础培养基作为对照进行培养。
      4. 在成脂培养基中培养细胞 14 天和 21 天，每 3 天更换一次培养基。在每个培养期结束时，进行油红O染色（步骤2.4.3.5-2.4.3.7），这是细胞内脂质积累的指示剂。
      5. 从每个孔中吸出培养基。用PBS洗涤细胞两次。将细胞固定在 2 mL 10% 福尔马林中 1 小时。用PBS清洗一次，然后用水清洗一次。
      6. 用 2 mL 油红 O 溶液在 60% 异丙醇中染色 5 分钟。用蒸馏水清洗一次。
      7. 用 2 mL 1% 苏木精在蒸馏水中按 1:2 稀释 1 分钟进行复染。用蒸馏水洗涤直至去除染色溶液，并使用光学显微镜观察染色的样品。
   4. 功能表征:软骨分化
      1. 使用胰蛋白酶/ EDTA分离细胞（如步骤2.3.1至2.3.2中所述），收集并离心细胞（如步骤2.4.1.2和2.4.1.2中所述），并计数它们（如步骤2.2.4中所述）。
      2. 将 5 x 10⁵ ADSC 放入四个聚丙烯锥形管中，并以 450 x g 离心 5 分钟以形成沉淀。丢弃上清液。
      3. 在软骨形成培养基（步骤1.6.1）或仅基础培养基（分化控制）中培养锥形管中的沉淀14和21天，在37°C的5%CO₂中培养14和21天。每 3 天更换一次培养基，避免去除颗粒。
         注:每个细胞沉淀是指每个培养时间，以及它们各自的对照品，仅用基础培养基生长。
      4. 在每个培养时间点结束时，使用细尖镊子收集沉淀，并将它们置于 24 孔板中。继续进行蛋白聚糖和糖胺聚糖的组织学切片和染色（步骤2.4.4.5.-2.4.4.9）。
         注意:每个颗粒都在一个单独的孔中处理。
      5. 将沉淀固定在 2 mL 10% 缓冲甲醛中 30 分钟。弃去甲醛溶液，加入 2 mL 70% 乙醇。使用尖端从锥形管中取出颗粒，并将颗粒嵌入石蜡中。
      6. 使用旋转石蜡切片机，制作 5 μm 组织学切片。将切片在60°C孵育15分钟，并将它们浸入二甲苯中两次（5分钟和15分钟）。
      7. 通过将组织学切片浸入浓度降低（100%，96%，80%和70%）的酒精浴中各2分钟，然后用去离子水冲洗5分钟，使样品再水化。
      8. 继续用1%的阿尔新蓝在乙酸（pH 2.5）中对样品进行染色30分钟。
      9. 用苏木精复染1分钟，并用蒸馏水洗涤。用 DPX（组织学封片剂）或其他封片溶液封片，并使用光学显微镜观察样品。

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结果

根据此处介绍的方案从脂肪组织中提取的细胞显示出符合ISCT提出的MSCs最低标准的形态。该协议的概述如图 1 所示。从表型上看，ADSCs在细胞培养的第一天表现出对塑料和成纤维细胞样形态的粘附（图2A）。此外，它们均匀生长并形成殖民地。此外，ADSCs的造血标志物CD34（2.12%）和CD45（1.81%）表达低，CD71（42.6%）、CD29（74.2%）和CD90（55.1%）均为间充质细?...

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讨论

间充质干细胞可以从不同的组织中提取。尽管骨髓在小鼠和人类中都是间充质干细胞的常见来源^25,26，^但我们选择在这项研究中使用脂肪组织，因为它富含间充质干细胞、在体内的分布以及易于获取。作为一种替代方案，脂肪来源的干细胞可用于产生MSCs样永生化细胞²⁷。

对于此处共享的协议的成功，提取的一些要?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)