活线粒体染色在细胞分选中纯化人诱导多能干细胞肝细胞的应用

摘要

来源于多能干细胞的肝细胞可以通过细胞分选进行纯化，使用线粒体和活化的白细胞粘附分子（ALCAM，也称为CD166）染色的组合。

摘要

人胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）由于其无限增殖和多能特性，在基于细胞的再生医学中具有治疗严重疾病器官的潜在应用。然而，由于人 ES/iPS 细胞对环境的高度敏感性，将人 ES/iPS 细胞分化为 100% 纯的靶细胞类型具有挑战性。移植后的肿瘤发生是由被污染的、增殖的和未分化的细胞引起的，因此高纯化技术对于安全实现再生医学至关重要。为了降低肿瘤发生的风险，已经开发了一种针对人 iPS 细胞来源的肝细胞的高纯度技术。该方法采用FACS（荧光激活细胞分选），使用高线粒体含量和细胞表面标记物ALCAM（活化的白细胞粘附分子）的组合，无需基因修饰。使用该方法的纯化肝细胞中±97%0.38%（n = 5）表现出白蛋白表达。本文旨在提供该方法的详细程序，应用于最新的人iPS细胞到肝细胞的二维分化方法。

引言

胚胎干细胞和诱导多能干细胞（分别为 ES 和 iPS）被认为是再生疗法的有前途的细胞来源。然而，即使使用相同的细胞系、方案和实验者 1,2,3,4，^将这些细胞分化为特定靶细胞类型的效率也可能有所不同。这种变异性可能归因于人类 ES/iPS 细胞对其环境的高敏感性。因此，目前很难一致地获得纯的靶细胞。为了实现高度安全的再生医学，消除治疗细胞中的增殖细胞和未分化干细胞至关重要，而针对靶细胞的先进纯化技术是必不可少的^5,6,7。

细胞分选仪是一种设备，可以立即分析单个细胞，并根据荧光信号强度对感兴趣的活细胞进行分选，提供了一种有前途的解决方案。这可以通过对细胞类型特异性表面标记物进行抗体染色或利用细胞类型特异性报告基因表达来实现。使用这种技术，有几篇关于纯化多能干细胞来源的心肌细胞 ^8,9,10

研究方案

本研究使用商业获得的人 iPS 细胞（253G1 菌株）（参见 材料表）。

1. 人iPS细胞的维持

1. 在涂有 0.25 μg/^{cm 2} iMatrix-511 的培养皿上，在 AK02 培养基中将人 iPS 细胞保持在无饲养层条件下（参见 材料表）。

2. 人 iPS 细胞在 2D 培养物中的肝分化

注：请参阅 图1A 了解肝分化的每日时间表。在整个过程中，使用 6 孔培养板并向每个孔中加入 2 mL 指定的洗涤或培养基。在37°C下保持100%湿度，5%CO₂和20%O₂ 的细胞培养条件。

1. 用1mL基底膜基质（在PBS（-）中稀释1/25））包被6孔板的每个孔，并在37°C下孵育1小时。
2. 使用补充有 10 μM ROCK 抑制剂 （Y-27632） 的 AK02N 培养基以 20,000-30,000 个细胞/cm² 的密度将人 iPS 细胞传代到包被培养皿上（参见 材料表）。第二天更换不含 Y-276....

讨论

由于肝细胞在营养代谢和解毒方面的功能，与其他细胞类型相比，肝细胞拥有相对较多的线粒体¹⁵。ALCAM是免疫球蛋白超家族的成员，在细胞粘附和迁移中发挥作用。它在多种细胞类型中表达，包括肝细胞、上皮细胞、淋巴细胞、髓样细胞、成纤维细胞和神经元细胞¹⁶。通过结合使用基于线粒体的方法和ALCAM抗体，成功鉴定了人iPS细胞来源的肝细胞。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159