用于体外研究的豚鼠圆窗膜移植

摘要

该协议概述了一种从豚鼠颞骨中移植圆窗膜的方法，为 离体 研究提供了宝贵的资源。

摘要

高效和微创的药物输送到内耳是一项重大挑战。圆窗膜（RWM）是内耳为数不多的入口点之一，已成为研究的重要焦点。然而，由于分离RWM的复杂性，我们对其药代动力学的理解仍然有限。RWM 由三个不同的层组成：外上皮层、中间结缔组织层和内上皮层，每个层都可能具有独特的递送特性。

目前用于研究跨 RWM 转运的模型利用依赖于细胞培养物或膜片段的体内动物模型或离体 RWM 模型。豚鼠是研究内耳内药物药代动力学的经过验证的临床前模型，也是耳蜗递送载体转化开发的重要动物模型。在这项研究中，我们描述了一种移植具有周围耳蜗骨的豚鼠 RWM 用于台式药物递送实验的方法。这种方法允许保留原生 RWM 架构，并且可以提供比当前台式模型更真实的运输障碍表示。

引言

已经出现了用于治疗感音神经性听力损失的新型疗法。这些疗法在临床人群的转化受到安全有效的内耳运输途径的限制。目前在动物研究中 的体内 递送方法依赖于开窗进入内耳或通过圆窗膜 （RWM） 扩散，圆窗膜是一种将中耳间隙与耳蜗分开的非骨屏障¹。

手术开窗和显微注射到内耳都是侵入性的，可能会对残余内耳功能构成风险².因此，RWM 是局部药物递送的重要途径，豚鼠是主要的临床前动物模型，用于研究 RWM 和内耳的局部药物药代动力学，用于药物开发 ^3,4。虽然比人类RWM更薄，但豚鼠RWM具有相同的三层结构。它的直径约为 1 mm，厚度为 15-25 μm，由夹在结缔组织层⁵ 中的两个上皮细胞层组成。面向中耳的上皮层密集堆积，并通过紧密的连接连接，而面向内耳和鳞状鼓膜的层结构较松，没有明显的细胞间粘连。

目前调查豚鼠 RWM 药物渗透性的临床前研究依赖于体内中耳注射，然后对内耳内的外淋巴液进行采样，这不允许对 RWM 转运进行特异性研究 ^6,7

研究方案

所有动物程序均由机构动物护理和使用委员会 （GP18M226） 批准。本研究使用了哈特利白化豚鼠（雄性和雌性，体重 500-700 克）。

1. 程序设置和准备

1. 在开始实验之前，用环氧乙烷对所有仪器进行灭菌。
2. 按照机构批准的方案对动物实施安乐死。
   注意：在目前的研究中，采用非预充电室从商用气瓶中释放 100% 二氧化碳 （CO₂）。根据 2020 年 AVMA^{指南 11}，使用在线限流器调节气体流量，将其保持在每分钟腔室体积的 30% 至 70% 范围内。
3. 将动物置于腔室中并分配二氧化碳5分钟，呼吸停止后保持CO₂ 流动1分钟。
4. 呼吸骤停后进行斩首，以确保安乐死。

2. 手术入路和移植

1. 以通常的方式从豚鼠头骨中提取颞骨¹².用 rongeur 去除多余的软组织。识别外耳道、颞大疱和面管¹³ （图 1）。
2. 用 6 mm 的金刚石钻头钻掉颞大疱的腹侧（见 材料表

讨论

在局部药物递送至耳部时，RWM 是治疗药物到达内耳的主要途径。需要一个准确可靠的台式模型来更好地了解新型递送载体和药物开发的运输机制和渗透性。在这项研究中，我们证明了豚鼠 RWM 移植是一种可行且可靠的程序，可以对药物-膜相互作用进行系统研究。Lundman 等人和 Kelso 等人先前使用类似的 RWM 渗透率模型 ^2,16 进行了描述;然而，到目前为止，?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST