用于结构和生化研究的人溶质载体的高通量表达和纯化

摘要

人膜转运蛋白的结构和生化研究需要毫克量的稳定、完整和均匀的蛋白质。在这里，我们描述了使用密码子优化基因筛选、表达和纯化人类溶质载体转运蛋白的可扩展方法。

摘要

溶质载体 （SLC） 是膜转运蛋白，可导入和输出一系列内源性和外源性底物，包括离子、营养物质、代谢物、神经递质和药物。尽管这组蛋白质已成为有吸引力的治疗靶点和疾病标志物，但目前的药物仍然相对不足。这些转运蛋白的药物发现项目受到有限的结构、功能和生理知识的阻碍，最终是由于这类膜包埋蛋白的表达和纯化困难。在这里，我们展示了使用密码子优化基因序列获得高纯度、毫克量的人SLC转运蛋白的方法。结合对构建体设计和高通量表达的系统探索，这些方案确保了靶蛋白的结构完整性和生化活性的保存。我们还重点介绍了这些蛋白质的真核细胞表达、亲和纯化和尺寸排阻色谱的关键步骤。最终，该工作流程可产生纯净、功能活性和稳定的蛋白质制剂，适用于高分辨率结构测定、转运研究、小分子结合测定和高通量 体外 筛选。

引言

长期以来，膜蛋白一直是研究人员和制药行业的目标。其中，溶质载体 （SLC） 是一个由人类基因组中编码的 400 多个次级转运蛋白基因组成的家族¹。这些转运蛋白参与许多分子的进出口，包括离子²、神经递质³、脂质⁴、⁵、⁶、⁷、氨基酸⁸、营养素⁹、10^、11 和药物 ¹²。由于底物如此广泛，这些蛋白质还通过毒素 13 的转运、滥用药物^14、15 的转运和抑制或有害突变¹⁶ 与一系列病理生理学有关。细菌同源物已成为几个SLC家族17,18,19,20,2....

研究方案

注：所有密码子优化的RESOLUTE SLC基因均已沉积在AddGene⁴³中，其链接可在RESOLUTE公共试剂⁴⁴列表中找到。这些基因已被克隆到 pDONR221 质粒中，并允许使用重组克隆⁴⁵ 将基因直接克隆到目标载体中。为了最大限度地提高平行性，细菌，昆虫和哺乳动物细胞以块形式生长，分别用于杆粒生产（第3节），杆状病毒扩增（第5节）和表达测试（第6节）。对于这些步骤，需要微表情振荡器以确保充分的混合和通气。

1. 将SLCs（高通量）克隆到pHTBV1.1杆粒中

注：克隆步骤使用重组克隆方案进行高效克隆，并使用热休克方法⁴⁶转化为大肠杆菌（大肠杆菌）。该方案专为多个靶标或构建体的高通量和并行克隆而设计，但可以很容易地适应较小的规模。

1. 在 96 孔板中，加入 150 ng pDONR221 SLC 克隆和 100 ng pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW 载体。用 10 mM Tris pH 8.0 将反应体积调至 8 μL，然后加入 2 μL 重组酶混合物。
2. 在室温下孵育1小时，加入1μL蛋白酶....

讨论

由于缺乏对转运蛋白功能的系统表征，SLC靶向疗法的开发仍然受到阻碍。这导致相对于 GPCR 和离子通道⁶³ 靶向该蛋白质类别的药物不成比例地减少，尽管它们在正常和病理生理过程中具有许多作用。RESOLUTE是一个国际联盟，旨在开发尖端的研究技术和工具，以加速和改进当前的SLC研究。作为RESOLUTE的一部分，我们开发了这些方案，用于人类SLC的高效克隆、构建体筛选以及大规模表.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent