火坦解毒通络汤对 H 型高血压大鼠的降压作用及机制

摘要

在这里，我们提出了一种诱导 H 型高血压的方案，并评估了胃内给药的火坦解毒通络汤 （HTJDTLD） 的抗高血压效果。在 H 型高血压大鼠中，HTJDTLD 具有有效的降压作用，可能与抑制内质网 （ER） 应激诱导的细胞凋亡通路激活有关。

摘要

H 型高血压是一种以血浆同型半胱氨酸 （Hcy） 水平升高为特征的特殊高血压，已成为全球面临的重大公共卫生挑战。本研究探讨了常用于治疗血管狭窄的高效中药方剂火坦解毒通络汤 （HTJDTLD） 的降压作用和潜在机制。蛋氨酸诱导大鼠 H 型高血压，HTJDTLD 经胃内给药。然后，通过无创大鼠尾部测压法测量大鼠尾动脉的收缩压和舒张压。通过苏木精-伊红 （HE） 染色进行主动脉的组织学评估。采用酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测 Hcy 水平，定量逆转录酶聚合酶链反应 （qRT-PCR） 和蛋白质印迹法测定葡萄糖调节蛋白 78 （GRP78） 、肿瘤坏死因子 （TNF） 受体相关因子 2 （TRAF2） 、c-Jun N 末端激酶 （JNK） 和 caspase-3 的 mRNA 和蛋白水平。结果显示，蛋氨酸治疗后 HTJDTLD 可显著降低血压，减轻组织病理学病变，降低 Hcy 水平。此外，HTJDTLD 显著抑制 GRP78 、 JNK 、 TRAF2 和 caspase 3 的基因和蛋白表达，这些基因主要参与内质网 （ER） 应激诱导的细胞凋亡途径。总体而言，结果表明 HTJDTLD 对 H 型高血压大鼠具有有效的降压作用，并揭示了与抑制 ER 应激诱导的细胞凋亡通路激活相关的降压机制。

引言

高血压是心脏病发作、中风和肾功能衰竭的主要风险因素，已成为影响全球 10 亿人的重大公共卫生挑战¹。同型半胱氨酸 （Hcy） 是一种含硫醇基团的氨基酸，是蛋氨酸代谢的重要代谢中介。血浆 Hcy 水平升高的高血压定义为 H 型高血压，这可能是中风等心脑血管疾病发生和复发的重要危险因素 ^2,3。最近的研究报告指出，H 型高血压共存可能会加重心脑血管疾病的副作用⁴。值得注意的是，中国 75% 的 H 型高血压患者患有原发性高血压，严重影响生活质量⁵。目前，H型高血压的治疗主要包括西医。但可能会引起一定的不良反应和依从性差，不能再满足H型高血压综合管理的需要。

中医 （TCM） 在中国是一种独特的资源，已有 2,000 多年的历史。由于西医对高血压控制的需求未得到满足，临床医生已经开始考虑中医在预防和治疗 H 型高血压中的潜在作用⁶。火坛解毒通络汤 （HTJDTLD） 是由邓悦教授根据其广泛的临床专业知识配制的中药配方⁷.经过 20 多年的临床应用，HTJDTLD 在治疗心脑血管疾病方面显示出显著的疗效¹。然而，HTJDTLD 是否对 H 型高血压有治疗作用尚未见报道。因此，我们旨在探讨 HTJDTLD 对 H 型高血压大鼠的降压作用和特异性机制，并确定治疗 H 型高血压的潜在治疗药物。

研究方案

所有动物实验均经长春中医药大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。材料表列出了这些材料。

1. 动物和治疗

1. 将总共 50 只成年自发性高血压大鼠 （SHR） （雄性，50 天龄） 随机分为 5 组，包括对照组 （CON）、蛋氨酸 （MET）、MET + HTJDTLD + 马来酸依那普利 （EM）、MET + EM 和 MET + HTJDTLD 组。
   注意：实验大鼠被安置在受控环境中，旨在确保它们的舒适和福祉。该设施的温控室设置为恒定 22 °C，相对湿度为 40-60%。笼子由透明聚碳酸酯制成，为每只大鼠提供了充足的自由活动空间。照明计划遵循 12 小时的光照/暗周期，模拟自然日光条件。为大鼠提供足够的食物和水。
2. 为大鼠提供以下饮食 28 天。
   1. 给 MET 组大鼠 3% 蛋氨酸饮食 28 天以诱导 H 型高血压。
   2. 当大鼠除 3% 蛋氨酸饮食外，以 1 mL/kg 的剂量用 HTJDTLD （1.633 g/mL） 和 EM （0.2 mg/mL） 灌胃给予 MET + HTJDTLD + EM 组中的大鼠。
   3. 除了 3% 蛋氨酸饮食外，还通过管饲法分别用 HTJDTLD 或 EM 给 MET +EM 和 MET + HTJDTLD 组中的大鼠施用。
      注：HTJDTLD 由 毛 梢果 （20 g）、丹 参 （15 g）、 金粳 粳 （30 g）、 根 茎 （15 g）、 当归 （15 g）、甘 草 （10 g）、 水豆 （5 g）、红 景 天 （15 g） 和 玄 参 （15 g） 组成，并按先前报道的煎煮⁷.溶于纯化水 （0.2 mg/mL） 的 EM 用作阳性对照。

2. 血压测量

注意：使用无创血压计进行血压测量（材料表）。

1. 治疗 28 天后，每组大鼠禁食 12 小时并测量血压。
2. 选择与大鼠大小相匹配的约束装置。本研究中使用的约束装置包括圆柱形约束网、帆布罩、热管和稳定泡沫垫。将大鼠放入约束网中，将约束网放入保温管中，然后将保温管放入帆布罩中。
3. 将信号线放在盖子下的合适位置。将鼠尾放在盖子上的缝隙中，并将其固定在稳定垫上。无人、安静和温暖的环境是测量的首选。提前 20-30 分钟将大鼠移至测量部位，以便大鼠适应测量环境。
   注意：可以多次执行步骤 2.2-2.3 以稳定大鼠。经过几次训练后，大鼠会习惯它，并且可以很快稳定下来，这便于后续的血压测量。
4. 连接加压传感器的空气软管连接、信号连接和固定管。将增压传感器放在尾部的尖端。
5. 测量血压。将鼠尾插入传感器后会出现脉搏波。按 Start/Stop 开始/停止测量。
   注意： 该设备将自动判断老鼠的尾巴是否插入传感器。当大鼠的尾巴未插入时，加压传感器不会开始加压，也不会进行测量。
6. 血压测试完成后， 结果 菜单会自动弹出。在 “结果 ”菜单中检查测量值的平均值、标准偏差 （SD）、标准误差 （SE） 和变异系数 （CV）。
   注：测量每只大鼠的血压 3 次，间隔 2 min 以上，计算平均值。
7. 测量血压后，通过腹膜内注射过量的 2% 戊巴比妥钠 （100 mg/kg） 对大鼠实施安乐死。然后，使用手术剪刀和带齿的镊子，从会阴到颈部逐层解剖大鼠。翻转胸腔和腹腔内容物，导航到两个肾脏之间的腹主动脉分叉处，并将主动脉收集到主动脉弓的一部分。

3. 苏木精-伊红 （HE） 染色

1. 将主动脉血管组织固定在 4% 多聚甲醛中至少 24 小时。
2. 取维管标本，在梯度醇中脱水，在二甲苯中使其透明，然后包埋在石蜡中。
3. 包埋后，制作 3-5 mm 厚的连续切片。在 60-70 °C 下干燥切片，然后在室温 （RT） 下储存。
4. 将切片浸入二甲苯 I 30 分钟、二甲苯 II 30 分钟、100% 酒精 I 10 分钟、100% 酒精 II 10 分钟、95% 酒精 I 5 分钟、95% 酒精 II 5 分钟、80% 酒精 5 分钟，然后用蒸馏水冲洗。
5. 用 Harris 苏木精染色切片 5 分钟，然后用自来水冲洗 5 分钟。在 1% 盐酸醇中分化 10 秒，然后在自来水中彻底冲洗 15 分钟。用氨水清洗切片 5 秒，然后用自来水彻底冲洗 15 分钟。
6. 进行显微镜观察，用伊红染色 10 分钟，然后用自来水彻底冲洗 15 分钟。
7. 将切片浸入 80% 乙醇 10 秒、95% 酒精 I 5 分钟、95% 酒精 II 5 分钟、100% 酒精 I 10 分钟、100% 酒精 II 10 分钟、二甲苯 I 10 分钟和二甲苯 II 10 分钟。
8. 使用中性胶密封切片。
9. 在光学显微镜（100 倍物镜，1000 倍放大倍率）下观察主动脉组织的组织学变化。

4. Masson 三色染色

1. 进行类似于 HE 染色的常规脱蜡。
2. 苏木精染色：将玻片浸入苏木精溶液中 10 分钟，然后立即用自来水冲洗。
3. 将玻片浸入 1% 盐酸溶液中几秒钟，然后立即用自来水冲洗。
4. 将载玻片浸入 Lichtenstein 酸性洋红色染色剂中 5 分钟，然后用水冲洗。
5. 将载玻片浸入 1% 磷酸钼酸中 5 分钟。
6. 将载玻片浸入 2% 苯胺蓝染色中 5 分钟，将 1% 冰醋酸浸入洗涤溶液中 1 分钟。然后，在 95% 酒精中快速滴洗载玻片 3 次。
7. 进行类似于 HE 染色的常规脱水、透明和中性胶密封。

5. 通过 ELISA 测量 Hcy

1. 通过腹膜内注射 2% 戊巴比妥钠 （45 mg/kg） 麻醉大鼠，并通过捏脚趾确认麻醉深度。抱住大鼠，剪掉胡须，避免采血时接触。用弯曲的镊子取出大鼠的眼球，并将血液收集在准备好的无菌微量离心管中。然后，通过腹膜内注射过量的 2% 戊巴比妥钠 （100 mg/kg） 对大鼠实施安乐死。
2. 让血液在 RT 下自然凝固 10-20 分钟，然后在 2-8 °C 下离心 （626-1409 x g） 血液约 20 分钟。
3. 小心收集上清液并将其储存在 -80 °C 的冰箱中。
4. 根据试剂盒说明稀释试管中的标准品。
5. 设置空白孔（空白对照孔中未添加样品和酶试剂;其余步骤相同）、标准孔和待测样品孔。将 50 μL 标准品加入板中，将 40 μL 样品稀释液加入样品孔中，然后加入 10 μL 血清（样品的最终稀释度为 5 倍）。
   注：将样品添加到板孔的底部;尽量不要触摸井壁，轻轻摇晃混合。
6. 用密封膜密封板，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
7. 用蒸馏水稀释 30 倍浓洗液 30 倍，准备使用。
8. 小心地撕掉密封膜，倒掉液体，摇晃以去除所有液体。用洗涤液填充每个孔，放置 30 秒，然后丢弃。重复此操作 5 次，然后轻拍干燥。
9. 向每个孔中加入 50 μL 酶试剂，空白孔除外。
10. 使用密封膜密封板，然后在 37 °C 下孵育 30 分钟。
11. 重复步骤 5.8。
12. 向每个孔中加入 50 μL 显色剂 A，然后加入 50 μL 显色剂 B，轻轻摇晃以充分混合。在 37 °C 下在弱光下孵育 10 分钟。
13. 向每个孔中加入 50 μL 终止液以终止反应（蓝色将变为黄色）。
14. 用空白孔将反应归零，并在 450 nm 处依次测量每个孔的吸光度（OD 值）。
    注意：测量应在添加终止液后 15 分钟内进行。

6. RNA 提取和定量 RT-PCR

1. 提取总 RNA。
   1. 将新鲜的主动脉组织快速切成合适的大小（30-50 毫克/块），并在液氮中彻底研磨。加入 1 mL Trizol 试剂，充分混合，并在冰上孵育 10 分钟以裂解组织。
   2. 在 4 °C 下以 2250 x g 离心 10 分钟。 小心地将上清液转移到新的微量离心管中，无需沉淀。
   3. 加入 200 μL 氯仿，剧烈摇晃 15 秒，并在 RT 下孵育 5 分钟。
   4. 在 4 °C 下以 2250 x g 离心 15 分钟。 混合物将分为三层：底部苯酚-氯仿有机相、中间相和上层水相。
   5. 小心地将上层水相转移到新的微量离心管（约 60% 体积的 Trizol）中。不要吸出中间相;可留少量上部液体。
   6. 加入等体积的异丙醇，倒置约 10 次轻轻混匀，然后在室温下放置 10 分钟。
   7. 在 4 °C 下以 2250 x g 离心 10 分钟。 弃去上清液，用 1 mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀物两次。
   8. 在 4 °C 下以 2250 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并在室温下风干 5-10 分钟。
   9. 将 RNA 溶解在 15-50 μL 焦碳酸二乙酯 （DEPC） 水中，并检查 RNA 浓度。
2. 进行逆转录和 RT-qPCR（表 1）
   1. 通过 qRT-PCR 检测与内质网应激 （ERS） 和细胞凋亡相关的基因表达。使用步骤 6.1 中提取的总 RNA，并根据制造商的说明使用 cDNA 合成试剂盒将其逆转录为 cDNA。
   2. 使用实时荧光定量 PCR 检测系统和 SYBR Green PCR 预混液，反应体积为 20 μL，测定基因表达。
   3. 通过 ^2-ΔΔCT方法定量分析数据，并将其表示为相对于 β-肌动蛋白表达的 n 倍差异。引物如 表 2 所示。

7. 蛋白质印迹 （WB）

1. 提取总组织蛋白。
   1. 在 1-2 mL 匀浆器的球形部分放置少量组织块，并用干净的剪刀尽可能多地剪断组织块。
   2. 加入 400 μL （w：v=1：10） 的 RIPA 裂解缓冲液并匀浆。然后，将其放在冰上。几分钟后，再次研磨并置于冰上。重复研磨过程几次。
   3. 裂解 30 分钟后，使用移液器将裂解物转移到 1.5 mL 离心管中，并将管放入预冷的 4 °C 离心机中。以 2250 x g 离心 10 分钟，然后将上清液转移到新的 1.5 mL 离心管中。
2. 定量蛋白质。
   1. 根据试剂盒的说明稀释蛋白质标准品。获得标准品的梯度如下：0、25、125、250、500、1000、1500 和 2000 ng/μL。
   2. 取 2.5 μL 蛋白质样品，使用样品稀释剂将其稀释至 25 μL（10 倍）。
   3. 取 96 孔板，向孔中加入 20 μL 标准蛋白样品（根据浓度梯度）和目标蛋白，每个目标蛋白质样品分别加入两个孔。
   4. 通过将液体 A 和液体 B 以 50：1 的比例混合来制备显影液（即用型），并向每个孔中加入 200 μL 显影液。
   5. 将添加样品的 96 孔板置于 37 °C 的培养箱中 30 分钟。
   6. 检测 562 nm 处的吸光度。
   7. 计算要测量的蛋白质浓度。
      1. 以标准蛋白浓度为垂直坐标，以 562 nm 处的吸光度为水平坐标，绘制标准曲线。
      2. 根据从标准曲线获得的公式和测得的目标蛋白质的吸光度计算目标蛋白质的浓度。
   8. 在微量离心管中向 20 μL 蛋白质样品中加入 180 μL 上样缓冲液。将离心管置于金属浴中，在 100 °C 下变性 10 分钟。使用变性蛋白 WB 或将其储存在 -20 °C。
3. 进行免疫印迹。
   1. 配置蛋白质电泳凝胶。
      1. 清洁并吹干凝胶灌注玻璃板（1 mm 或 1.5 mm），并将其固定在凝胶灌注装置上。
      2. 根据 表 3 制备 10% 分离凝胶。在玻璃板之间添加配置的分离凝胶。缓慢加入凝胶溶液，以避免产生气泡。然后，加入适量的无水乙醇，使分离器的液面变平。在 RT 下放置 20-30 分钟，直到凝胶凝固。
         注：分子量越高，胶水浓度越低，根据需要配制其他浓度的分离胶。
      3. 根据 表 3 制备 5% 浓缩凝胶。分离凝胶凝固后，倒出上层无水乙醇，充满浓缩凝胶，慢慢插入与玻璃板匹配的凝胶梳（注意不要有气泡）。将其在 RT 下放置 20-30 分钟，使浓缩的凝胶凝固。
   2. 进行电泳。
      1. 称取 60.5 g Tris、375 g 甘氨酸和 20 g 十二烷基硫酸钠 （SDS）。加水至 2 L，在 60 °C 加热，搅拌溶解，形成 10 倍电泳溶液。让解在 RT 处;使用时将其稀释至 1 倍。
      2. 从凝胶浇注装置中取出含有胶水的玻璃板，以匀速拉下水流中的胶梳，同时排空取样孔中的气泡。
      3. 将玻璃板固定在电泳槽中，并加入配置的 1x 电泳溶液。确保内胆已满，并且外胆是内胆的一半。
      4. 在样品添加孔中加入相同质量的蛋白质样品和 5 μL 标记物（用于指示蛋白质的大小）。
      5. 在 60 V 下运行凝胶 20 分钟，然后在 100 V 下运行90 分钟，直到上样缓冲液流至底部。
   3. 进行膜转印。
      1. 称取 60 g Tris 和 288 g 甘氨酸，加水至 2 L。搅拌并充分溶解溶液，制成 10x 膜转印溶液，并在室温下保留，以 1：2：7 的比例稀释（10x 跨膜溶液：甲醇：水），制成 1x 工作溶液。
         注意：应提前制备跨膜溶液，并在冰箱中冷却至 4 °C。
      2. 将 PVDF 浸泡在甲醇中适当的时间（0.5-1 分钟），以激活膜上带正电荷的基团，使其更容易与带负电荷的蛋白质结合。
      3. 取膜转移夹，按顺序放置组分后固定（黑色表面-海绵-滤纸-电泳凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白色表面依次排列）。
         注意： 小心避免气泡;当有气泡时，使用滚筒将气泡排出。
      4. 将夹板放入膜转移槽中，注意遵循正确的电极放置，将两个冰袋放入槽中，并装满 1x 膜转移液。最后，将整个跨膜槽放入冰中。
      5. 将膜转移条件设置为 100 V 1 小时。
         注：膜转移时间可根据蛋白质的大小进行调整;蛋白质的分子量越小，膜转移时间越短。
   4. 执行阻塞。
      1. 对于磷酸化蛋白，使用 5% BSA（溶剂 TBST）作为封闭溶液。对于非磷酸化蛋白质，使用 5% 脱脂牛奶（溶剂 TBST）进行封闭。
      2. 将封闭液倒入适当大小的培养皿中。将 PVDF 膜放入培养皿中，并确保 PVDF 膜浸没在封闭溶液中。关闭培养皿并在 RT 下孵育 1 小时。
      3. 取下膜。根据标记物显示和每种靶蛋白的大小，将膜切成合适的大小并用序列号标记。
   5. 孵育抗体
      1. 除去封闭液，用滤纸吸取残液。将相应的切割PVDF放入相应的抗体稀释液（包括CPR78 [1：1000]、TRAF2 [1：1000]、p-JNK [1：1000]、半胱天冬酶[1：1000]和GAPDH [1：1000]）中，并将其置于4°C的旋转振荡器上过夜。
      2. 加入 1x TBST 并在 RT 下冲洗 3 次（每次 10 分钟）。
      3. 按照制造商的说明，将 PVDF 膜在二抗稀释液中孵育，并在 RT 下孵育 1 小时。
      4. 通过在 RT 下加入 1x TBST 3 次（每次 10 分钟）冲洗膜。
   6. 显影 PVDF 膜。
      1. 在发光溶液试剂盒中混合等体积的液体 A 和液体 B，摇匀，准备使用。
      2. 将 PVDF 膜放在保鲜膜上铺展，并快速均匀地将配制好的发光剂快速均匀地添加到膜上。在 RT 下孵育 3 分钟，避光。
      3. 使用增强型化学发光 （ECL） western blotting 检测试剂检测蛋白质条带。

8. 数据分析

1. 将所有数据表示为 SD ±平均值。使用 SPSS 20.0 软件通过单因素方差分析执行统计分析。考虑当 p < 0.05 时具有统计显著性的差异。

结果

如 表 4 和 表 5 所示，MET 组收缩压 （SBP） 和舒张压 （DBP） 在 1 至 4 周内显著高于 CON 组。HTJDTLD 治疗后，大鼠 SBP 和 DBP 显著低于 MET 组。值得注意的是，HTJDTLD 和 EM 联合使用比单独使用 HTJDTLD 治疗具有更强的降压效果。

经 HE 染色和 Masson 三色染色，主动脉血管壁子宫内膜不完整且不光滑，中层明显增厚。与 CON 组相比，MET 组出现平滑肌细胞增殖和?...

讨论

高血压是最常见的心血管疾病之一，影响三分之一的成年人口，并增加中风、冠心病以及心肾衰竭的风险⁸。H 型高血压是一种特殊类型的高血压，是指原发性高血压和同型半胱氨酸水平升高同时发生，多年来引起了广泛关注⁹。近年来，口服 EM 联合降压药在控制血压和降低血液 Hcy 水平方面显示出更好的疗效，但仍存在许多禁忌症、副作用、耐药性以及头痛、头...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR	Yeasen,China	11149ES	cDNA synthesis kit
Anti-beta-actin antibody	Bioss, China	bs-0061R
Anti-caspase-3 antibody	Bioss, China	bs-0081R
Anti-GPR78 antibody	Abcam, USA	ab108513
Anti-JNK antibody	Abcam, USA	ab76572
Anti-p-JNK antibody	Bioss, China	bsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibody	Bioss, China	bs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibody	Bioss, China	bs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system	Bio-Rad	CFX96	real-time PCR detection system
ECL Western Blot Substrates	Merck, MA, USA	WBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tablets	Yangzijiang Pharmaceutical Company, China	20040991
FastStart SYBR Green Master	Sigma	FSSGMMRO
Fructus Trichosanthis	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Hirudo	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer	Beijing Softron Biotechnology company	BP-2010A
Lonicerae Japonicae Flos	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Methionine	Sigma, USA	M9500
Radix Angelicae Sinensis	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Glycyrrhizae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Nardostachyos	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae Crenulatae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix Scrophulariae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Rat Hcy ELISA Kits	Shanghai Meimian Industrial Company, China	MM-0293R2
RIPA buffer	Shanghai Beyotime Biotechnology company	P0013B