铜绿假单胞菌产生的单鼠李糖脂和二鼠李糖脂的检测和定量

摘要

铜绿假单胞菌产生鼠李糖脂生物表面活性剂。薄层色谱法检测并确定每种菌株产生的单鼠李糖脂和二鼠李糖脂的比例。总鼠李糖脂的定量涉及使用 orcinol 方法评估从培养上清液中提取的这些生物表面活性剂中存在的鼠李糖当量。

摘要

环境细菌铜 绿假单胞 菌是一种机会性病原体，具有高度抗生素耐药性，对健康构成危害。这种细菌产生高水平的生物表面活性剂，称为鼠李糖脂 （RL），这些分子具有重要的生物技术价值，但也与毒力特性有关。在这方面，RL 的检测和定量可能对生物技术应用和生物医学研究项目都有用。在本文中，我们逐步演示了使用薄层色谱法 （TLC） 检测 铜绿假单 胞菌产生的两种形式的 RL 产生的技术：单鼠李糖脂质 （mRL），由与一个鼠李糖部分相连的脂肪酸二聚体（主要是 C10-C10）组成的分子，以及二鼠李糖脂质 （dRL），由与两个鼠李糖部分相连的相似脂肪酸二聚体构成的分子。此外，我们提出了一种基于从 铜绿假单 胞菌培养上清液中提取的这些生物表面活性剂的酸水解以及随后检测与 orcinol 反应的鼠李糖浓度来测量 RL 总量的方法。两种技术的组合可用于估计特定菌株产生的 mRL 和 dRL 的近似浓度，如此处的类型菌株 PAO1 （系统群 1）、PA14 （系统群 2） 和 PA7 （系统群 3）。

引言

铜绿假单胞菌是一种环境细菌，也是一种机会性病原体，由于其产生毒力相关特征和高度抗生素耐药性而备受关注 ^1,2。这种细菌产生的特征性次生代谢物是生物表面活性剂 RL，它与几种毒力相关性状（如奋人静绿脓素，一种具有氧化还原活性的抗生素）和蛋白酶弹性蛋白酶³ 以协调方式产生。RL 的拉伸活性和乳化特性已在不同的工业应用中得到开发，目前已商业化⁴。

大多数铜绿假单胞菌菌株属于系统群 1 和 2，产生两种类型的 RL：mRL，它由一个鼠李糖部分组成，该部分与主要由 10 个碳组成的脂肪酸二聚体相连，以及 dRL，它包含一个与第一个鼠李糖⁴ 相连的额外鼠李糖部分（见图 1）。然而，据报道，两个次要铜绿假单胞菌系统群（第 3 组和第 5 组）仅产生 mRL ^5,6。两种类型的 RL 包含脂肪酸二聚体的混合物，如前所述，主要是 C10-C10，但也会产生较小比例的....

研究方案

此过程在 补充图 1 中示意图。用于研究的试剂和设备列在 材料表中。

1. 使用 TLC 检测铜绿假单胞菌培养上清液中的 mRL 和 dRL

1. 从感兴趣的铜 绿假单 胞菌菌株的离心肉汤开始，在液体培养基中培养 24 小时（以达到产生 RL 的生长稳定期）。通常，这些培养物每 mL 含有 1 x 10⁹ 个细菌。
2. 使用浓 HCl 将培养物的 pH 值调节至 2。
3. 将 5 mL 酸化培养上清液放入 50 mL 聚丙烯管中，并加入 5 mL 2：1 氯仿：甲醇混合物。
4. 倒置 3 次搅拌试管，每次 10 秒，每次搅拌之间不倒置试管 2 分钟。
5. 将试管不搅拌约 3 小时，直到两相分离，或在 4 °C 下以 3,000 x g 离心试管 10 分钟。
6. 将有机相（底层）转移到干净的试管中，并将试管放在提取罩中，直到出现干燥。
7. 从步骤 1.3 开始重复该过程，将来自第二个氯仿的有机相：甲醇萃取放入第一次萃取中使用的试管中。
8. 蒸发有机相，直到剩下 1 mL 或 1.5 mL。将此体积转移至 1.5....

讨论

检测和定量 RL 的最准确方法是 HPLC 与质谱联用 （MS）^7,8,27;但是，它需要专业且昂贵的设备，许多研究人员可能无法使用。此处描述的方法可以使用基本的实验室材料和设备常规进行检测和估计 RL 浓度，但它们有一些局限性，尤其是在测定 mRL 和 dRL 混合物方面不准确。此外，应仔细制备用于 RL 定量的样品。用于 RL 检测和定量.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C