在超短自组装肽基质中制备和表征来自 SW1222 细胞系的结直肠癌类器官

摘要

该方案旨在通过免疫染色评估生物功能自组装肽的细胞粘附、类器官形态和基因表达。我们将使用结直肠癌细胞系提供一种经济高效的方法来获取用于强化测试的类器官。

摘要

超短自组装肽 （SAP） 可以自发形成类似于细胞外基质的纳米纤维。这些纤维允许形成具有生物相容性、可生物降解和非免疫原性的水凝胶。我们之前已经证明，当 SAP 与蛋白质衍生基序进行生物功能化时，可以模拟支持结直肠类器官形成的细胞外基质特征。这些生物功能肽水凝胶保留了原始母肽的机械特性、可调性和可打印性，同时结合了允许细胞-基质相互作用以增加细胞粘附的线索。本文介绍了使用能够经济高效地形成结直肠癌类器官的腺癌细胞系评估和表征各种生物功能肽水凝胶对细胞粘附和管腔形成的影响所需的方案。这些方案将有助于使用免疫染色和荧光图像分析评估生物功能肽水凝胶对细胞粘附和管腔形成的影响。本研究中使用的细胞系以前已用于在动物源性基质中生成类器官。

引言

近年来，自组装肽 （SAP） 已成为组织工程应用中前景广阔的生物材料。SAP 具有独特的特性，包括纳米纤维的自发形成、生物相容性、生物降解性和非免疫原性，使其成为支架开发的有吸引力的候选者¹。SAP 以前曾与各种类型的细胞一起使用，值得注意的是，据报道，超短 SAP 促进了干细胞的包埋，同时在包括 30 多次传代在内的长时间内保持其多能性，并且染色体畸变的发生率最低 ^2,3,4。因此，调整 SAP 以用于类器官培养构成了合理的后续步骤。

类器官是由单个多能细胞产生的复杂三维结构。这些结构产生各种细胞类型，然后这些细胞类型自组织以复制体外胚胎和组织生长的发育过程 ⁵。这种创新框架已发展成为体外研究的强大工具，有效地保留了体内器官的遗传、表型和行为属性^{特征 6}。然而，基于类器官的结果从实验室到床边过渡的主要障碍是需要可重复性⁷。结果的这种差异主要归因于难以将人类多能干细胞完全分化为专门的细胞谱系，而缺乏真实的组....

研究方案

1. 缓冲液和溶液的制备

注：所有所述浓度均为最终浓度。

1. 添加终浓度分别为 10% 和 1% 的胎牛血清 （FBS） 和青霉素-链霉素，以制备完整的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基 （IMDM）。在 4 °C 下避光储存长达 1 个月。
2. 将 MgCl₂ （3 mM）、蔗糖 （300 mM） 和 Triton X-100 （0.5%） 与磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 混合以制备透化缓冲液。将此溶液在 4 °C 下储存长达 2 个月。
3. 将牛血清白蛋白 （BSA， 1%）、甘氨酸 （0.3 M） 和 Tween-20 （0.1%） 混合在 PBS 中，制备封闭缓冲液。将此溶液在 4 °C 下储存长达 2 个月。
4. 在无菌条件下用超纯水稀释 10 倍至 2 倍 PBS。将此溶液在室温下储存 6 个月以上。
5. 在紫外线下消毒 3 mg 肽粉 30 分钟。加入 500 μL 超纯水，使用涡旋混合器溶解。
   注：最终浓度必须为目标浓度的两倍，即 6 mg/mL，因为 1x 浓度为 3 mg/mL。

2. 用肽中的 SW1222 制造结直肠癌类器官

1. 将等分试样在 4 °C 下解冻过夜，并将其保存在冰中，直到....

讨论

SAP 在生物医学研究中的巨大潜力体现在它们通过生物功能化的延展性和适应性上。面对如此广泛的排列阵列，有效测试和确定特定应用（尤其是在类器官研究中）最有前途的配置的挑战出现了。快速、经济高效的解决方案至关重要。源自人结直肠腺癌的 SW1222 细胞系成为此类强化评估的关键候选细胞。在这里，我们提出了一种评估和表征在基于肽的基质中生长的类器官的方法。该协议承诺一种综?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015