识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境群体

摘要

本文介绍了从骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的小鼠模型中分离和表征骨髓微环境群体的详细方案。该技术可识别非造血骨髓生态位（包括内皮细胞和间充质基质细胞）随疾病进展的变化。

摘要

骨髓微环境由不同的细胞群组成，例如间充质基质细胞、内皮细胞、骨系细胞和成纤维细胞，它们为造血干细胞 （HSC） 提供支持。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞疾病的发展中发挥作用，例如骨髓增生异常综合征 （MDS） 和急性髓系白血病 （AML）。造血干细胞中 MDS 相关突变导致分化受阻和进行性骨髓衰竭，尤其是在老年人中。MDS通常可进展为难治性AML，这是一种以未成熟髓母细胞快速积累为特征的疾病。已知这些骨髓肿瘤患者的骨髓微环境会发生变化。在这里，描述了从骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的小鼠模型中分离和表征骨髓微环境细胞的综合方案。分离和表征骨髓生态位群体的变化有助于确定它们在疾病发生和进展中的作用，并可能导致开发针对骨髓基质群体中促癌改变的新疗法。

引言

骨髓微环境由造血细胞、非造血基质细胞和细胞外基质^{组成 1,2}。这种微环境可以促进造血干细胞自我更新，调节谱系分化，并为骨组织提供结构和机械支持1,2,3,4,5。基质生态位包括骨系细胞、成纤维细胞、神经细胞和内皮细胞⁶，而造血生态位由淋巴和髓系群体^{组成 1,2,3}。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还可以在造血干细胞疾病的发展中发挥作用，例如MDS和AML 7,8,9,10,11。骨系细胞的突变已被证明可促进 MDS、AML 和其他骨髓增生性肿瘤的发展 10,12,13,14。

骨髓增生异常综合征是一组由造血干细胞突变引起的白血病前期疾病。MDS 通常与 HSC 分化受阻和发育不良细胞的产生有关，这通常会导致骨髓衰竭。MDS是美国最常诊断的髓系肿瘤，3年生存率为35%-45%¹⁵。MDS通常与转化为急性髓系白血病的高风险有关。这可能是一种致命的并发症，因为MDS衍生的AML对大多数疗法都有抵抗力，并且可能复发。由于造血干细胞和祖细胞的易位或突变而新发的 AML 也通常对标准化疗产生耐药^{性 16,17}。由于MDS和AML主要是老年人的疾病，大多数患者在60岁以上被诊断出来，因此大多数患者不符合根治性骨髓移植的条件。因此，迫切需要确定疾病进展的新调节因子。由于骨髓微环境可以为恶性细胞^{提供支持14}，因此定义随着疾病进展的骨髓生态位的变化可能导致识别旨在抑制肿瘤生态位重塑的新疗法。因此，非常需要确定疾病进展的新调节因子。为此，识别和表征可能为恶性细胞提供支持的骨髓基质细胞群的变化至关重要。

已经生成了几种AML和MDS的小鼠模型，可用于研究疾病开始和进展期间骨髓微环境的变化6,1,19,20,21,22。在这里，描述了使用逆转录病毒诱导的 AML ^6,20 的小鼠模型以及市售的高危 MDS 到^{AML 转化 19} 的 Nup98-HoxD13 （NHD13） 模型来识别骨髓基质细胞群变化的方案。用从头移植 AML 细胞的小鼠在 20-30 天内死于该疾病⁶.NHD13小鼠在15-20周左右出现血细胞减少和骨髓发育不良，最终转化为AML，近75%的小鼠在32周左右死于这种疾病。为了分析小鼠模型骨髓微环境群体，收获骨骼，使用酶消化消化骨髓和骨针状体，然后通过磁性分选富集细胞以用于CD45-/Ter119-非造血群体。虽然之前已经描述了类似的分析11,13,22,23,24,25，但它们通常集中在骨髓或骨骼上，并且在分析中没有包括来自这两种来源的细胞。这些群体的综合表征与基因表达分析相结合，可以全面了解细胞造血微环境如何为疾病的发生和进展提供支持（图1）。虽然下面描述的方案侧重于逆转录病毒诱导的 AML 模型和遗传 MDS 模型，但这些策略可以很容易地用于研究任何感兴趣的小鼠模型的骨髓生态位的变化。

研究方案

所有动物实验均按照罗切斯特大学动物资源委员会批准的方案进行。小鼠在罗切斯特大学的动物护理设施中饲养和饲养。为了模拟高危 MDS，采用了市售的 NHD13 小鼠模型¹⁹。在该模型中，在疾病发作前 8 周龄的雌性 NHD13 小鼠中分析骨髓基质细胞。De novoAML的生成如前所述^6,11,20。用于诱导 AML 的癌基因，例如 MLL-AF9 和 NRas，用 GFP 或 YFP 标记，允许使用流式细胞术分析非白血病 GFP-骨髓群体。简而言之，将10周龄的雌性C57BL / 6J小鼠移植小鼠GFP / YFP + AML细胞，并在移植后2周收获骨髓。虽然本研究中使用雌性小鼠进行演示，但该协议可以在雄性或雌性小鼠中进行。它也可以使用一根股骨或所有长骨进行。

1. 骨髓采集

注意:有关动物解剖方案的详细信息，请参阅Amend等人²⁶。

1. 用70%乙醇清洁研钵和研杵，用冷却的FACS缓冲液冲洗（表1），并在开始收获之前将它们放在冰上冷却。此外，将MAC缓冲液（表1）放在工作台上，使其达到室温。
2. 按照机构动物护理和使用指南和协议对动物实施安乐死。
3. 在工作台上，用 70% 乙醇彻底喷洒鼠标，直到其皮毛变湿。使用镊子和弯曲的剪刀，提起腹部的皮肤，并在小鼠的两侧，从腹部外侧做两个约0.5毫米长的切口。接下来，在腹部远端做一个 0.5 毫米的切口。向下拉以去除鼠标腿上的皮肤和皮毛。
4. 将剪刀垂直于骨盆放置，向下按压，同时用镊子向上拉股骨。股骨头应与骨盆分离。在髌股关节处分离股骨和胫骨。将骨头放入FACS缓冲液中，放在冰上的6孔板中。
5. 使用实验室级组织从骨骼中取出组织，并将清洁后的骨骼放入新的 6 孔板中，并在冰上加入新鲜的 FACS 缓冲液。
6. 将所有骨头放入装有 2-5 mL FACS 缓冲液的研钵中，使所有骨头浸入缓冲液中（根据您正在处理的骨头数量调整缓冲液的体积）。用研杵打圈压碎和研磨骨头，直到骨髓组织被释放。
7. 使用 3 mL 注射器，通过从研钵中拉起并冲洗液体来均质化骨髓。
8. 使用 3 mL 注射器，从研钵中抽出液体，并通过 70 μm 细胞过滤器将其过滤到冰上的 50 mL 管中。用FACS缓冲液将过滤器中的骨/组织块冲洗回研钵中，然后返回步骤1.7进行均质化和第二次过滤。这构成了骨髓部分。
9. 用FACS缓冲液将剩余的骨块（针状体）冲洗回研钵中，并使用FACS缓冲液将其冲洗到15mL管中，以确保最大细胞产量。这是骨针状部分。

2.骨髓的消化

1. 在4°C下以300× g 离心骨髓5分钟。 倾倒并弃去上清液。
2. 将骨髓重悬于2mL骨髓消化混合物（表1）中，并将其转移到15mL管中。在旋转器上在37°C孵育45分钟。
3. 加入 10 mL FACS 缓冲液以停止酶消化。通过 70 μm 细胞过滤器将混合物过滤到新的 50 mL 管中。
4. 将混合物在4°C下以400× g 沉淀7分钟。
5. 将骨髓沉淀重悬于1mL红细胞裂解缓冲液中（参见 材料表）。在冰上孵育 4 分钟。
6. 加入 10 mL FACS 缓冲液以停止裂解。通过 70 μm 细胞过滤器将混合物过滤到新的 50 mL 管中。
7. 将混合物在4°C下以300× g 沉淀5分钟。 除去上清液并将沉淀重悬于100μL FACS缓冲液中。

3.骨针的消化

1. 涡旋步骤1.9中的骨针状物，让它们沉降。倒出上清液，将骨头保留在底部。
2. 将骨针重悬于1mL骨针状消化混合物中（表1）。
3. 将管子放在管旋转器上，在37°C下60分钟。
4. 加入 10 mL FACS 缓冲液以停止酶消化。通过 70 μm 细胞过滤器将混合物过滤到含有红细胞裂解和消化骨髓的 50 mL 管中。

4. 染色

1. 轻轻混合骨针和骨髓细胞悬浮液。
2. 使用10μL细胞悬液，使用0.4%台盼蓝染色在血细胞计数器上计数活细胞数，如已发表的方案²⁷中所述。从细胞悬液中收集 50,000 个细胞以获得未染色的对照。
3. 将剩余细胞在4°C下以300× g 离心5分钟。 除去上清液并将其重悬于100μL FACS缓冲液中。
   注意:可以滴定抗体以确定理想的稀释度。抗体选择（表位和荧光染料）可以定制。
4. 对于磁耗耗抗体染色，加入 FC Block（每 25 x 10⁶ 个细胞 1 μL）、CD45-APC（每 25 x 10⁶ 个细胞 10 μL）和 Ter119-APC（每 25 x 10⁶ 个细胞 4 μL）（参见 材料表）。
5. 在冰上孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤，除去50,000个细胞（~50μL）用于APC染色的对照，在4°C下以300× g 离心5分钟，并重悬于100μLFACS缓冲液中。
6. 为了用微珠染色细胞悬液以进行磁耗，加入mIgG（每25 x 10⁶ 个细胞8μL）和抗APC微珠（每25 x 10⁶ 个细胞20μL）（参见 材料表）。
7. 在冰上孵育20分钟。用10mL FACS缓冲液洗涤，在4°C下以300× g 离心5分钟。

5. 通过磁性分选去除样品

注意: 此步骤是根据制造商的说明使用市售的手动磁选机执行的。此步骤也可以使用自动分离器执行（参见 材料表）。

1. 用 2 mL MACs 缓冲液洗涤 LD 色谱柱（表 1）。丢弃污水并更换收集管。
2. 将多达 1 x 10⁸ 个细胞重悬于 MAC 缓冲液中，并通过带有 35 μm 细胞过滤器盖的 5 mL 试管过滤它们。
3. 将LD柱放在磁选机支架上。将 5 mL 试管放置在色谱柱下方以收集洗脱液。
4. 将细胞悬液加入制备的LD色谱柱中。让负性馏分流入收集管。用 1 mL MACs 缓冲液洗涤色谱柱两次，将洗脱液收集在同一管中。这是下面步骤 5.6 中使用的负分数。
5. 从磁选机支架上取下LD柱，并将其放在新的5 mL试管上。使用移液管将 3 mL 缓冲液分配到色谱柱中，以冲洗出已阳性标记的细胞，使用柱柱塞。
6. 在4°C下以300× g 离心负极和正极部分5分钟。 将它们重悬于100μL FACS缓冲液中。
7. 用 0.4% 台盼蓝计数 10 μL 的负极和阳性馏分。以下骨分析/内皮组染色的体积将基于该细胞计数。
8. 使用阳性组分的 50,000 个活细胞进行流式细胞术门控。

6. 骨分析/内皮面板染色

注意:应按照标准流式细胞术方案进行补偿，包括所有适当的染色和门控。

1. 对于CD45/Ter119阴性组分（每1×10⁶ 个细胞每种抗体1μL）的染色，加入CD31-PE-Cy7，Sca-1-BV421，CD51-PE和CD140a-PE-Cy5（参见 材料表）。
2. 在冰上孵育20分钟。用2mL FACS缓冲液洗涤，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。
3. 加入 1 mL FACS 缓冲液和 1:1000 稀释的 PI 进行活/死染色，然后通过带有 35 μm 细胞过滤器盖的 5 mL 试管过滤样品。
4. 在多色流式细胞仪上分析细胞。

结果

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于分析来自MDS和白血病小鼠模型的骨髓微环境群体，例如内皮细胞和间充质基质细胞（图1）。 图 2 描述了用于检测目标群体的门控策略，从通过前向和侧面散射曲线选择消化和 CD45/Ter119 耗尽部分中的细胞 （P1） 开始。白血病样品中细胞的门控示例如图1所示（图2A）。选择单峰，从该分...

讨论

小鼠白血病模型已被广泛用于识别促进侵袭性髓系白血病进展的细胞内在和生态位驱动信号^6,19,21。本文介绍了一种基于流式细胞术的综合方案，用于定义MDS和AML小鼠模型中骨髓微环境的细胞组成。

在从实验样品中获取流式细胞术数据之前，仔细补偿荧光重叠非常重要。包括所有适当的染色和门控也很重要...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038