多重环状荧光免疫组化

摘要

多重循环免疫组化允许使用重复抗原抗体孵育、图像扫描以及图像比对和整合同时原 位 检测多个标记物。在这里，我们介绍了使用该技术在肺癌和配对脑转移样本中鉴定免疫细胞底物的操作方案。

摘要

肿瘤微环境涉及宿主细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和脉管系统之间的相互作用。表征和空间组织免疫细胞亚群和靶蛋白对于预后和治疗目的至关重要。这导致了多重免疫组化染色方法的发展。多重荧光免疫组化可同时检测多种标志物，有助于全面了解细胞功能和细胞间相互作用。在本文中，我们描述了多重环荧光免疫组织化学测定的工作流程及其在淋巴细胞亚群定量分析中的应用。多重荧光免疫组化染色遵循与标准免疫组化类似的步骤和试剂，包括抗原修复、环状抗体孵育和福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织载玻片上的染色。在抗原-抗体反应过程中，制备来自不同物种的抗体混合物。优化和验证抗原回收时间和抗体浓度等条件，以提高信噪比。该技术是可重复的，可作为免疫治疗研究和临床应用的宝贵工具。

引言

脑转移瘤 （BM） 是最常见的中枢神经系统 （CNS） 肿瘤，发生在近一半的非小细胞肺癌 （NSCLC） 病例中，预后不良¹。据估计，10%-20% 的 NSCLC 患者在初始诊断时已经患有 BM，大约 40% 的 NSCLC 病例将在治疗过程中发生 BM²。肿瘤微环境 （TME） 与 NSCLC 的发生和 BM 密切相关，包括各种成分，如血管、成纤维细胞、巨噬细胞、细胞外基质 （ECM）、淋巴样、骨髓来源的免疫细胞和信号分子 ^3,4。微环境免疫细胞在影响癌细胞生长发育方面起着至关重要的作用。脑转移瘤具有许多潜在的治疗靶点，其特征是复杂的免疫微环境和信号传导过程。例如，PD-1 抑制剂作为免疫检查点抑制剂 （ICI） 已显示出对肺癌脑转移 （LCBM） 患者的临床疗效。然而，原发性 NSCLC 和 LCBM⁵ 对 PD-1 治疗的反应频率不同，这表明肿瘤免疫微环境充当关键的 ICI 调节因子。

免疫组化 （IHC） 是生物学、基础医学和病理学领域的宝贵工具⁶.该检测方法通过抗原-抗体在组织载玻片上的相互作用来可视化抗原表达⁷....

研究方案

该研究获得了云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院医学伦理委员会的批准。所有受试者/法定监护人均签署知情同意书。

1. 载玻片准备

1. 使用切片机切割含有原发性肺肿瘤或肺癌脑转移细胞的成对石蜡块切片，厚度为 4 μm。将切片取出到水中并用镊子分离，选择最好的切片并将其粘附在聚赖氨酸涂层的载玻片上。
2. 将组织载玻片置于65°C的烘箱中30分钟，以增强组织粘附。
3. 通过三次更换将载玻片浸入二甲苯中，每次持续 10 分钟。
4. 逐渐降低酒精浓度，将载玻片在100%乙醇中孵育5分钟，在90%乙醇中孵育5分钟，在75%乙醇中孵育5分钟，并在去离子水中孵育3分钟。

2. 热诱导表位检索 （HIER）

1. 在去离子水中将100x柠檬酸钠缓冲溶液（pH 6.0）稀释至1x（10mM），制备足够的缓冲溶液以完全浸没载玻片。
2. 将载玻片放入压力锅中，使其在高温（100°C）和压力（~30psi）下2分钟。加热后，让载玻片在蒸馏水中冷却至室温3分钟。
3. 将一包52g磷酸盐缓冲盐水（PBS;粉末状）溶解在5L去离子水中，用于制备PBS缓冲溶液（pH 7.0）。将载玻片置于PBS缓冲溶液中5分钟，更换3次。

讨论

我们已经描述了多重环状荧光免疫组化染色的过程。一抗选择是荧光免疫组化测定的一个关键方面，建议使用单克隆抗体以获得更好的特异性和可重复性。为了优化一抗的工作浓度，通过免疫组化实验测试了一系列稀释液。阳性对照（评估靶抗原表达）和阴性对照（无一抗孵育）都是必不可少的，应进行设置。

在该方案中，一抗被稀释并制备为来自不同物种的混合物。荧光?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418