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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

我们提出了使用称为 mScarlet 的荧光蛋白进行 Epon 嵌入后相关光学和电子显微镜的详细方案。这种方法可以同时保持荧光和超微结构。该技术适用于各种生物应用。

摘要

相关光电子显微镜（CLEM）是一种综合显微镜，它结合了荧光显微镜（FM）提供的定位信息和电子显微镜（EM）获取的细胞超微结构的背景。CLEM是荧光和超微结构之间的权衡，通常，超微结构会影响荧光。与其他亲水性包埋树脂（如甲基丙烯酸缩水甘油酯、HM20或K4M）相比，Epon在超微结构保存和切片性能方面更胜一筹。此前，我们已经证明mEosEM可以在四氧化锇固定和Epon包埋中存活。使用mEosEM，我们首次实现了EPON后嵌入CLEM，它同时保持荧光和超微结构。在这里，我们提供了有关 EM 样品制备、FM 成像、EM 成像和图像对齐的分步详细信息。我们还改进了在 EM 成像期间识别 FM 成像的相同细胞的程序，并详细说明了 FM 和 EM 图像之间的配准。我们相信，在传统的电磁设施中，按照这种新协议，可以很容易地实现嵌入相关光和电子显微镜的Epon后。

引言

荧光显微镜（FM）可用于获得靶蛋白的定位和分布。然而，靶蛋白周围的背景丢失了，这对于彻底研究靶蛋白至关重要。电子显微镜 （EM） 具有最高的成像分辨率，可提供多个亚细胞细节。然而，EM缺乏靶标标记。通过将FM采集的荧光图像与EM采集的灰度图像精确合并，相关光电子显微镜（CLEM）可以将这两种成像模式1,2,3,4获得的信息结合起来。

CLEM 是荧光和超微结构之间的权衡 1.由于目前荧光蛋白和传统电镜样品制备程序的局限性，特别是使用锇酸（OsO4）和疏水性树脂（如Epon），超微结构总是影响荧光5。OsO4 是 EM 样品制备中不可或缺的试剂，用于提高 EM 图像的对比度。与其他包埋树脂相比，Epon 在超微结构保存和切片性能方面更胜一筹5。然而，在OsO4 和Epon embedding6处理后，没有荧光蛋白可以保留荧光信号。为了克服荧光蛋白的局限性，开发了预包埋 C....

研究方案

畜牧业和实验经福建医科大学医学中心机构动物护理与使用委员会批准。当前协议的分步工作流程如 图 1 所示。

1. 样品制备

  1. 小鼠大脑
    1. 购买转基因小鼠（见 材料表）和寡核苷酸引物（见 材料表）对这些小鼠进行基因分型。
    2. 按照先前发布的方案12,13 灌注并从颅穹窿中取出完整的大脑。
    3. 用10mL固定溶液（参见 材料表）在4°C过夜。
    4. 用0.1M磷酸盐缓冲液（PB）冲洗掉固定溶液3×10分钟。
    5. 使用振荡切片机将小鼠大脑切成500μm厚度的切片（参见 材料表）。
    6. 使用立体显微镜用手术刀将荧光区域切成小块（参见 材料表）。
      注意： 小块的体积不得大于 1 mm3。
  2. 培养细胞
    1. 将 HeLa 细胞接种到 6 cm 细胞培养皿中，并将它们维持在生长培养基（Dulbecco 改良的 Eagle 培....

代表性结果

先前的报道表明，mScarlet可以靶向溶酶体15。在该方案中，使用立体定位仪器将表达 mScarlet 的 AAV （rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA） 注射到 Vglut2-ires-cre 小鼠大脑的 M1 （ML： ±1.2 AP： +1.3 DV： -1.5） 中。按照上述协议，最终的相关图像如图4A所示。使用金纳米颗粒（绿点）作为基准标记，FM图像可以与EM图像精确对齐。如EM图像（图4C，F

讨论

这里介绍的方案是一种通用成像方法，它可以结合光学显微镜 （LM） 中靶蛋白的定位信息和电子显微镜 （EM） 中靶蛋白周围的背景6。由于目前荧光蛋白的局限性，广泛使用的方法是预嵌入相关光和电子显微镜 （CLEM），这意味着 LM 成像是在 EM 样品制备之前完成的。几乎所有现有的荧光蛋白都可以在预包埋CLEM中进行检查。然而，由于不可避免的失真和收缩，最终图像的精确对?.......

披露声明

作者没有利益冲突需要声明。

致谢

该项目得到了国家自然科学基金（32201235傅志飞）、福建省自然科学基金（2022J01287致傅志飞）、福建医科大学先进人才研究基金（XRCZX2021013傅志飞）、福建省金融专项科学基金（22SCZZX002致傅志飞）的支持。 国家卫健委非人灵长类动物生育力调控技术评价重点实验室、福建省妇幼保健院成立（2022-NHP-04致傅志飞）。我们感谢福建医科大学公共技术服务中心的Linying 周、Minxia Wu、习 Lin和Yan 胡在EM样品制备和EM成像方面的支持。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)Shanghai yuanye Bio-TechnologyR26284
25% Glutaraldehyde (GA)Alfa AesarA17876Hazardous chemical
Abbelight 3DNanolnsights
AcetoneSCR10000418
Ammonium hydroxideJ&K Scientific335213
BioPhotometer D30eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
CoverglassWarner64-0715
DABCO Sigma290734Hazardous chemical
DDSASPI companyGS02827Hazardous chemical
Desktop centrifugeWIGGENSMINICEN 10E
Diamond knifeDiATOMEMX6353
DMP-30SPI companyGS02823Hazardous chemical
DNA transfection reagentThermo Fisher 2696953Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812 SPI companyGS02659Hazardous chemical
EthanolSCR10009218
Fiji image JNational Institutes of Health
Fixative solution 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
FormvarSigma9823
GlycerolSCR10010618
Gold nanoparticlesCorpuscular790120-010
Gradient resinAcetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acidSCR10011118
Hydrogen peroxideSCR10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamberThermo Fisher A7816
Large gelatin capsulesElectron Microscopy Sciences70117
Mounting bufferMowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88Sigma9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2OSCR10020318
NaH2PO4 ž2H2OSCR20040718
NMASPI companyGS02828Hazardous chemical
Oligonucleotide primersTakara Biomedical Technology (Beijing)Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtomeLeicaVT1000S
Osmium tetroxideSCRL01210302Hazardous chemical
OsO4 solution1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
ParafilmAmcorPM-996
Paraformaldehyde (PFA)SCR80096618Hazardous chemical
Perfusion buffer4% PFA+0.1 M PB
PioloformSigma63148-65-2Hazardous chemical
Poly-L-lysine Sigma25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) SCR10016818
Scalpel bladesMerckS2771
Scalpel handlesMerckS2896-1EA
StereomicroscopeOLYMPUSMVX10
Transgenic miceThe Jackson LaboratoryVglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.  
Transmission electron microscope (TEM)FEITECNAL G2
UA solution (2% UA)Aqueous solution
UltramicrotomeLeicaLEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)TED PELLA19481Hazardous chemical

参考文献

  1. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  2. Kopek, B. G., et al.

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