建立子宫内膜异位症实验小鼠模型以研究其相关的不孕症

摘要

本研究介绍了一种专门设计用于模拟子宫内膜异位症的新型小鼠模型，子宫内膜异位症是一种具有临床意义的亚型。该模型利用 C57BL/6J 小鼠，旨在阐明子宫内膜异位症相关不孕症的病理生理机制，为弥合当前生殖医学的知识差距提供一种精细的工具。

摘要

子宫内膜异位症 （OMA） 是子宫内膜异位症的一种亚型，其特征是在卵巢中形成子宫内膜异位囊肿，影响 17-44% 的被诊断患有子宫内膜异位症的个体。患有 OMA 的女性经常会出现生育能力受损，但 OMA 相关不孕症的确切机制仍不清楚。值得注意的是，现有的动物模型模拟了浅表性腹膜子宫内膜异位症 （SUP） 和深部浸润性子宫内膜异位症 （DIE），在专注于 OMA 的研究中留下了明显的空白。为了应对知识差距，本文介绍了一种开创性的 OMA 模拟小鼠模型，并全面描述了该模型中采用的技术和程序。凭借 83% 的高成功率和卵巢病变特异性，该模型为推进我们对 OMA 的理解具有重要前景，尤其是在不孕症的情况下。它为对 OMA 相关的生育挑战进行有针对性的研究提供了一个有价值的平台，可能为改进生殖医学领域的诊断和治疗策略铺平道路。

引言

子宫内膜异位症 （OMA） 是子宫内膜异位症最主要的亚型，在大约 17-44% 被诊断患有子宫内膜异位症的个体中观察到 ^1,2。它的特征是在卵巢内形成子宫内膜异位囊肿。这些囊肿，俗称“巧克力囊肿”，因其独特的棕色焦油状稠度而得名³。除了 OMA，子宫内膜异位症还可以表现为浅表性腹膜子宫内膜异位症 （SUP） 和深部浸润性子宫内膜异位症 （DIE）。SUP 是指腹膜内膜上的病变，而 DIE 是指穿透腹膜表面下超过 5 毫米的病变⁴。这些子宫内膜异位症亚型在病变位置、外观和深度方面的异质性导致不同的临床症状和不同的疾病严重程度 ^5,6。OMA 与更严重的子宫内膜异位症阶段特别相关，并且与不孕症、盆腔粘连和卵巢癌风险增加有关 1,7,8,9。

子宫内膜异位症，尤其是 OMA，与不孕症的相关性是一个值得严重关注的临床问题。子宫内膜异位症存在于 25-50% 的不孕妇女中，30-50% 被诊断患有子宫内膜异位症的女性会出现不孕症 10,11,12,13,14。虽然确切的 OMA 相关不孕机制仍然难以捉摸，但已经提出了一些假设。一种研究表明子宫内膜异位症会导致慢性炎症状态，这会破坏正常的卵巢功能并损害卵母细胞质量^15,16。另一个提出卵巢卵泡液中异常的铁超负荷，这被认为与卵母细胞成熟障碍有关¹⁴。其他研究涉及荷尔蒙调节¹⁷ 、卵母细胞质量¹⁸ 和胚胎发育¹⁹ 的中断。

从历史上看，啮齿动物模型在加深我们对子宫内膜异位症的理解方面发挥了至关重要的作用，特别是在研究其病理学、对生育能力的影响和疼痛机制方面 20,21,22,23。啮齿动物，尤其是大鼠和小鼠，已被广泛用作动物模型，以探索这种疾病的因果关系、潜在机制、潜在的诊断技术和治疗干预 22,24,25,26。重要的是要认识到所有动物模型都有其特定的用途和局限性。特定模型的选择取决于所测量或研究的特定结果或方面²⁷。例如，大鼠模型表明，压力会加剧子宫内膜异位症的表现并影响炎症参数，从而深入了解疾病的潜在诱因²⁸。

在子宫内膜异位症研究的背景下，采用了各种啮齿动物模型。一种常用的方法是同源模型，它涉及将啮齿动物子宫组织移植到同一物种的腹膜腔或肠系膜血管中²⁹。该模型在免疫能力和长期研究的适用性方面具有优势³⁰。然而，由于植入的异位小鼠子宫组织与人类子宫内膜异位病变的特征之间存在部分差异，因此出现了局限性³¹。另一种方法是异源模型，其中将人子宫内膜活检植入免疫抑制小鼠³²。该模型允许使用人类异位子宫内膜作为病变发展的供体组织，提供建设性有效性³²。然而，它依赖于免疫抑制的小鼠作为受体，这阻碍了对涉及疾病病因的免疫反应的全面评估³³。然而，重要的是要承认现有模型主要侧重于反映广义条件 SUP，没有充分捕捉 OMA 和 DIE³⁴ 的独特特征。目前，可用于研究 DIE 的特定模型很少，只有少数模型存在，包括 Yan 等人最近开发的啮齿动物模型³⁵。这种稀缺性凸显了进一步研究和开发准确捕捉 DIE 特定特征的模型的必要性。此外，我们对 OMA 的理解，尤其是它与生育率的细微关联，也仍然有限^26,36。

针对现有挑战，本文提出了一种新颖的实验同源小鼠模型，旨在专门模拟 OMA。它旨在为 OMA 相关不孕症的病理机制提供独特的见解，从而弥合生殖医学这一关键领域的知识差距。简而言之，C57BL/6J 小鼠因其类似人类的生殖特性而被使用。在发情周期同步后，将供体小鼠的子宫组织切碎并以 1：2 的比例移植到受体小鼠的卵巢滑囊中。间隔 4 周后，对卵巢病变进行形态学和组织学检查，以验证 OMA 的存在并评估任何相关的滤泡闭锁。该模型的成功率为 83%，为研究人员提供了一个可靠的 OMA 研究平台，强调病变发展，特别是卵巢中的病变发展以进行重点调查。

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研究方案

本研究中进行的所有实验程序均由香港中文大学伦理委员会根据协议编号 21-203-MIS_[C] 批准和监管。

1. 动物适应和选择

1. 小鼠制备
   1. 从信誉良好的供应商处获得 18 只 C57BL/6J 小鼠（初产雌性，8-9 周龄：6 名供体，12 名受体）。验证健康证书。
   2. 将所有小鼠保持在受控的住房环境中：22-24°C，湿度水平在 40% 和 60% 之间，并具有 12 小时的光照/黑暗循环。使用经过 HEPA 过滤的空气（如果有）。
   3. 允许小鼠持续驯化 72 小时，持续获取食物和水，最大限度地减少人际互动以减轻压力。
2. 发情周期同步
   1. 收集含有雄性信息素的垫料;将其引入雌性笼中 48 小时。
3. 阴道细胞学检查
   1. 第二天早上进行阴道细胞学检查。
      注意：有必要在一天中的一致时间进行涂片检查，通常是上午 9：00。
      1. 提前准备双头棉签、高压灭菌的 PBS、35 毫米培养皿和载玻片。在培养皿中分配 10 mL PBS。将棉签的一端浸入 PBS 中，使其吸收液体。
      2. 轻轻地从笼子中取出一只老鼠，并将其放在空笼子的盖子上。
      3. 用一只手的拇指和食指抓住尾巴，另一只手拿起湿棉签，小心翼翼地插入老鼠的阴道。小心地将拭子棒的尖端插入鼠标阴道约 1.0 cm 的深度。轻轻旋转拭子，同时保持与动物身体长轴约 45° 的角度。
         注意：在插入过程中缓慢旋转拭子有助于更顺畅的手术，并最大限度地减少对子宫颈的潜在刺激。
      4. 通过不断旋转拭子轻轻去除阴道腔和阴道壁上的细胞，然后小心地取出拭子。
         注意： 在此过程中，请确保棉签连续旋转，同时注意不要与周围的毛发接触。之后，小心地取出棉签以避免任何潜在的污染。
      5. 将拭子尖端轻轻滚动到干净的、预先标记的载玻片上，转移收集的细胞。
         注意：将细胞转移到载玻片后，应丢弃拭子棒，并为每只动物使用新的拭子棒。
      6. 在显微镜下检查载玻片以检测角质化上皮细胞。在阴道细胞学中寻找角质化上皮细胞的均匀存在，这表明发情期。拍摄照片并记录观察结果。
         注意：凭借适当的专业知识，无需对阴道涂片进行染色。但是，如果实验者无法在不被染色的情况下“读取”涂片，那么这是必要的。

2. 子宫内膜异位症模型建立

注：在模型建立中，仅选择发情期的小鼠作为供体和受体小鼠。对一只老鼠进行实验时，请确保它远离其他人的视线，并且在完全恢复之前不要将其重新引入其他动物的陪伴。模型生成图如图 1 所示。

1. 供体组织制备
   1. 用氯胺酮 （75 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 的组合镇静供体小鼠。在麻醉下通过宫颈易位对供体小鼠实施安乐死。
   2. 用 70% 乙醇棉签对腹部区域进行消毒。
   3. 使用无菌手术剪刀沿腹膜中线切开一个切口（1 厘米），露出肌肉层。选择另一把手术剪刀剪断肌肉层并露出骨盆腔。
   4. 关闭镊子的尖端，并使用钝的中央部分轻轻提起肠道。
   5. 找到子宫和卵巢组织。对整个子宫角进行无菌解剖，包括两个子宫角，确保被移除的碎片的大致尺寸为 ~1.5 厘米长。将切除的组织放入含有 PBS 的培养皿中，并去除任何多余的脂肪组织。
   6. 使用消毒的手术刀将组织细碎地解剖成 1 mm³ 的小块。通过定期添加 PBS 保持组织湿润。
2. 移植手术
   1. 用氯胺酮 （75 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 的混合物麻醉受体小鼠。
   2. 涂抹眼药膏以防止手术过程中眼睛干涩。将小鼠仰卧在无菌手术板上。
   3. 通过轻轻纵小鼠的后腿来确定手术部位，在皮肤下可触及骨突起。这个突出点通过皮肤清晰可见，在外科手术过程中作为受体小鼠卵巢的可靠解剖标志物。
   4. 剃掉手术部位，确保周围 150% 的区域清除毛皮。然后，用交替轮换的 betadine 和 70% 酒精对皮肤进行消毒至少 3 次。使用无菌手术单，以防止组织、无菌器械和缝合线与任何残留的毛皮接触。最后，在预定的手术部位创建一个精确的侧切口 （3-5 mm）。
   5. 用非惯用手镊子稳定卵巢。轻轻将 100 μL PBS 注入卵巢滑囊中，观察轻微分离。
   6. 在滑囊中开一个小缝。使用微型镊子移植子宫组织碎片 （1 mm³）。
      注意：避免过度填充，以防止对周围组织造成压力。
   7. 对于假手术，复制除步骤 2.2.6 之外的所有步骤。
3. 术后护理
   1. 用可吸收缝合线（即 5-0 维克林）缝合肌肉层，用不可吸收缝线（即 5-0 尼龙）缝合皮肤。
   2. 将鼠标放在设置为 37 °C 的加热垫上，直到完全恢复意识。监测呼吸并等待四肢变成粉红色。
   3. 每 12 小时施用丁丙诺啡（0.1 mg/kg，皮下注射）治疗疼痛，持续 48 小时。前 24 小时每 8 小时检查一次疼痛、感染或痛苦的迹象，然后在接下来的 3 天内每天 3 次。
      注意：在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，它不会无人看管。

3. 模型验证

1. 粗体验证
   1. 4 周后，使用氯胺酮 （75 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 的组合麻醉受体小鼠。然后，在深度麻醉下，通过进行宫颈易位对小鼠实施安乐死。
   2. 做一个中线切口，露出腹腔进行器官检查。
   3. 提取有可见病变的卵巢并拍照。
   4. 彻底检查外来的子宫内膜异位病变。
2. 组织学验证
   注：由于组织学实验中存在潜在的刺激性气味溶剂，因此应在通风橱中进行。
   1. 将卵巢与病变一起固定在 10% 中性缓冲福尔马林中。
   2. 按照 Adeniran 等人 ³⁷ 描述的相同程序处理组织，包括组织分配、固定和包埋。
   3. 连续切片 4-5 μm 厚的组织，漂浮在 45 °C 的水浴中，并安装在载玻片上。用小鼠编号、卵巢侧和切片编号清楚地标记载玻片。在 37 °C 下干燥过夜。
   4. PAS-苏木精染色
      1. 脱蜡：将玻片放入二甲苯或二甲苯替代品中以去除石蜡。
         注意：您可能需要多次执行此步骤。
      2. 再水化：通过将载玻片置于一系列降低的乙醇浓度（100%、95%、80%、70%）中，逐渐为组织切片再水化。
      3. 高碘酸处理：用 1% 高碘酸溶液覆盖组织切片，让它们在室温下静置 5-10 分钟。
         注：此步骤将组织的乙二醇基团氧化成醛基，从而与 Schiff 试剂反应并形成紫粉色染色以指示卵巢结构。
      4. 用蒸馏水彻底冲洗载玻片以去除任何残留的高碘酸。
      5. 用 Schiff 溶液对组织切片染色 15 分钟。
      6. 首先用流动的热自来水冲洗玻片以去除多余的污渍，然后用蒸馏水冲洗。
      7. 用 1 g/L 的 Meyer 苏木精对切片复染 2-3 分钟。
      8. 用流动的自来水冲洗玻片 2-3 分钟。
      9. 涂抹 Bluing 试剂 30 秒。
      10. 用蒸馏水冲洗玻片。
      11. 通过将切片浸入不断增加的乙醇浓度（70%、80%、95% 和 100%）中来逐渐脱水。
      12. 将这些切片浸入透明剂（例如二甲苯）中，使其透明。
      13. 在载玻片上的切片上涂抹封固剂，轻轻地将盖玻片放在切片上，确保没有气泡。让玻片在罩中风干，以促进封固剂的凝固。
   5. 在光学显微镜下检查。记录子宫内膜腺体、基质和出血性囊肿的存在，证实卵巢中存在子宫内膜异位症。

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结果

OMA 的成功成立
在接受移植方案的 12 只小鼠中，10 只在大体解剖学和组织学水平上表现出特征性 OMA 病变，成功率为 83%。大体检查显示充满液体的病变粘附在卵巢上，让人想起临床 OMA 表现（图2）。如图 3 所示，组织病理学检查证实了异位子宫内膜组织成功植入。此外，子宫内膜异位病变的浸润导致植入物旁卵?...

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讨论

OMA 在全球女性人群中的患病率凸显了一个关键的健康问题³⁸。除了子宫内膜异位症的一般症状外，OMA 还给生育能力带来了额外的挑战，包括严重的盆腔疼痛、卵巢扭转的可能性和其他显着影响^39,40。虽然对 OMA 发病机制和进展的理解在很大程度上笼罩在神秘之中，但知识真空不仅阻碍了靶向治疗策略的制定，?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe with 25 G needle	BD Biosciences	301320
10 mm Tissue culture dish	FALCON	353001
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
10x phosphate buffered saline (PBS) buffer	Fisher Scientific	AM9625
30 G needle	BD Biosciences	305107
5-0 black braided silk non-absorbable suture	Ethicon Inc.	W500H
70% Ethanol
Adhesive microscope slides	Marienfeld	810401
Buprenorphine Injection	Med-Vet International	RXBUPRENOR5
Double-headed cotton swab	SANYO Co., LTD.	HUBY-340
Fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Ketamine	Alfasan International b.v	2203095-08
Microtubes	Corning	MCT-150-C
Needle holder	Excelta Corporation	2827-NH-35-SE-ND
Ophthalmic ointment	Major Pharmaceuticals	10033691
Periodic Acid Schiff (PAS) Stain Kit	Abcam	Ab150680
Powder free sterile gloves	Fisher Scientific	19020558
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	15-197-700A
Size 3 scalpel	Fisher Scientific	22-079-657
Small serrated semi-curved forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135
Small surgical scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5850
Standard light microscope			For evaluating vaginal cytology smears and histological analysis.
Steel scalpel blades #10	B.Braun	BB510
Sterile gauze	MEDICOM	HMWS 077
Sterilized pyrex glass Petri dishes	Corning	70160-101
Thermoregulated electric pad
VICRYL RAPIDE (polyglactin 910) absorbable Suture	Ethicon Inc.	W9918
Xylazine	Alfasan International b.v	2110333-10