基于生物发光共振能量转移 （BRET） 的测定法，用于测量 CRAF 与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用

摘要

该方案描述了一种基于 BRET 的测定法，用于测量 CRAF 激酶与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用。该协议概述了准备细胞、读取 BRET 发射和数据分析的步骤。还提供了一个示例结果，其中确定了适当的对照和分析优化的故障排除。

摘要

CRAF 是 RAS GTP 酶的主要效应子，在几种 KRAS 驱动的癌症的肿瘤发生中起关键作用。此外，CRAF 是种系突变的热点，种系突变被证明会导致发育性 RASopathy、Noonan 综合征。所有 RAF 激酶都包含 14-3-3 调节蛋白的多个磷酸化依赖性结合位点。14-3-3 与这些位点的差异结合在信号转导条件下质膜上活性 RAF 二聚体的形成和在静止条件下维持 RAF 自抑制中起着重要作用。了解这些相互作用如何被调节以及如何调节它们对于确定靶向 RAF 功能的新治疗方法至关重要。在这里，我描述了一种基于生物发光共振能量转移 （BRET） 的测定法，用于测量 CRAF 与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用。具体来说，该测定法测量了与纳米荧光素酶供体融合的 CRAF 和与 Halo 标签受体融合的 14-3-3 的相互作用，其中 RAF 和 14-3-3 的相互作用导致供体到受体的能量转移和 BRET 信号的产生。该方案进一步表明，该信号可以被显示阻止 14-3-3 与其每个高亲和力 RAF 停靠位点结合的突变破坏。该实验步骤描述了接种、转染和重新铺板细胞的程序，以及读取 BRET 发射、进行数据分析和确认蛋白质表达水平的详细说明。此外，还提供了示例分析结果以及优化和故障排除步骤。

引言

RAF 激酶 （ARAF、BRAF 和 CRAF） 是 RAS GTP 酶的直接效应子，也是促增殖/促存活 RAF-MEK-ERK 激酶级联反应的起始成员。最近的研究表明，CRAF 表达在几种 KRAS 驱动的癌症的肿瘤发生中起关键作用，包括非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌 ^1,2,3,4,5。此外，种系 CRAF 突变会导致一种特别严重的 RASopathy，即 Noonan 综合征 ^6,7。了解 CRAF 调节对于开发针对其在细胞中的功能的成功治疗方法至关重要。

所有 RAF 激酶均可分为两个功能结构域，即 C 端催化 （CAT） 结构域和 N 端调节 （REG） 结构域，用于控制其活性（图 1A）⁸。REG 结构域包括 RAS 结合结构域 （RBD）、富含半胱氨酸的结构域 （CRD） 和富含丝氨酸/苏氨酸的区域 （S/T 富集）。值....

研究方案

注：该测定在 293FT 细胞中进行。来源于人胚胎肾细胞的特征明确且易于转染的上皮细胞系。这些细胞的单个汇合 10 cm 培养皿通常提供足够的细胞来接种 6 孔组织培养板的 20 孔。步骤 1-3 必须在生物安全柜中使用无菌技术进行。

1. 细胞接种（第 1 天）

注：在此步骤中，将细胞从组织培养皿中分离出来，计数并接种在 6 孔组织培养板中，以便在步骤 2 中进行转染（图 2）。

1. 从 10 cm 培养皿中的细胞中吸出培养基。用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞并吸出。
2. 加入 1 mL 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA），并在 37 °C 下孵育 3-5 分钟，以将细胞从培养皿中分离出来。
3. 向细胞中加入 9 mL 完全 Dulbecco 改良的 eagle 培养基 （DMEM） 以中和胰蛋白酶，并反复上下移液以产生均匀的单细胞悬液。
4. 立即将 20 μL 细胞转移到 1.7 mL 试管中，并与 20 μL 台盼蓝染色剂混合。使用自动细胞计数仪（材料表）或血细胞计数器对细胞进行计数。
5. 在完全 DMEM 培养基中将细胞稀释至 2 x 10⁵ 个细胞/mL，并向 6 ....

讨论

先前的研究表明，14-3-3 蛋白在 RAF 激酶的激活和抑制中起关键作用。了解这些结合事件如何被调节以及调节这些相互作用对 RAF 信号转导和 RAF 驱动的肿瘤发生的影响可能会发现针对 CRAF 功能的新治疗脆弱性。然而，Raf 激活周期受到大量相关蛋白、翻译后修饰和亚细胞定位变化的支持⁸，因此，为了完全概括这些条件，必须在活细胞条件下测量 RAF 与其调节因子的相互作用。该协?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228