来源于大鼠的脱细胞脾基质的制备

摘要

脱细胞脾基质（DSM）在肝组织工程领域具有广阔的应用前景。该方案概述了制备大鼠DSM的程序，其中包括收获大鼠脾脏，通过灌注使它们脱细胞，并评估所得的DSM以确认其特性。

摘要

肝移植是终末期肝病的主要治疗方法。然而，供体器官的短缺和质量不足需要开发替代疗法。利用脱细胞肝基质 （DLM） 的生物人工肝 （BAL） 已成为有前途的解决方案。然而，寻找合适的 DLM 仍然具有挑战性。已经探索使用脱细胞脾基质 （DSM） 作为 BAL 的基础，提供了一种现成的替代方案。在这项研究中，使用冻融循环和去细胞试剂灌注相结合的方式收获大鼠脾脏并进行脱细胞。该协议保留了 DSM 内细胞外基质 （ECM） 的微观结构和成分。完整的脱细胞过程大约需要 11 小时，从而在 DSM 内产生完整的 ECM。组织学分析证实了细胞成分的去除，同时保留了 ECM 的结构和组成。所提出的方案提供了一种获得 DSM 的综合方法，在肝组织工程和细胞治疗中提供了潜在的应用。这些发现有助于开发治疗终末期肝病的替代方法。

引言

肝移植仍然是终末期肝病的唯一确定性治疗方法^1,2,3。然而，供体器官的严重短缺和质量下降增加了对替代疗法的需求⁴.在再生医学领域，利用脱细胞肝基质 （DLM） 的生物人工肝 （BAL） 已成为有前途的解决方案^5,6,7。DLM 保留了原始的肝脏结构，包括其错综复杂的微血管网络和 ECM 的组成部分，为创建可移植的 BAL 提供了支架，这可能会缓解肝脏疾病。

尽管前景广阔，但这项技术的采用仍面临挑战，特别是在寻找合适的DLM方面。 人源性DLMs供不应求，而来自动物源的DLMs则存在疾病传播和免疫排斥的风险。在一种创新的方法中，我们的研究探索了使用脱细胞脾基质 （DSM） 作为 BAL^的基础 8,9,10,11。

研究方案

本研究经习交通大学动物实验伦理委员会批准，按照《实验动物护理与使用指南》开展。

1.脾脏采摘

1. 使用体重250-280g的雄性Sprague Dawley大鼠。将大鼠安置在温度和湿度受控的房间中，并 随意为它们提供食物和水，手术前禁食除外。
2. 术前 1 小时皮下注射丁丙诺啡 （0.05 mL/kg） 作为镇痛剂。通过异氟烷吸入麻醉大鼠。在有机玻璃盒中使用1.5 L/min的流速的5%异氟烷进行诱导麻醉，并通过面罩以0.6-0.8 L/min的流速保持麻醉2%异氟烷。通过捏住脚趾来确认麻醉的深度。
3. 使用电动剃须刀刮除整个腹部的皮肤。将大鼠仰卧在手术台上。通过背静脉注射 2 mL 肝素化盐水（1,000 U 肝素）以达到全身抗凝。用聚维酮碘溶液对剃光的皮肤进行消毒，并用无菌布覆盖。
4. 用手术剪刀在腹部做一个十字形切口，用止血钳拉伸暴露腹腔，然后将肝脏朝向横膈膜翻转。将胃肠道外侧置于腹部右侧，并用湿纱布覆盖。
5. 小心地分离并切断脾胃韧带，露出脾门。
   注意：脾脏呈淡红色细长结构，大小约为 3.0 cm x 0.6 cm x 0.6 cm，可在左腹部识别。
6. 沿脾门解剖，逐渐分离并暴露肝总动脉、胃十二指肠动脉和脾动脉。结扎并切断胃十二指肠动脉和肝总动脉，同时逐渐解离周围组织。
7. 将脾脏向右侧翻转，露出腹....

讨论

BALs代表了治疗终末期肝病的有效方法，特别是在肝移植因目前供体器官短缺而受到阻碍^{的情况下6。}制造 BAL 的一个有前途的选择是利用 DLM，它保留了天然肝脏的天然 ECM 和血管结构。然而，人类DLM的稀缺性以及与动物DLM相关的感染和免疫原性的潜在风险构成了重大限制。为了应对这一挑战，我们提出了一种新的策略，涉及采用脱细胞脾基质 （DSM） 作为^BAL、

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Machine	Harvard Apparatus	tabletop	animal anesthesia
bubble trap	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	pore diameter: 5 μm	prevent air bubbles
Buprenorphine	TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd		an analgesic
Hemostatic Forceps	Shanghai Medical Instruments  Co., Ltd	J31020	surgical tool
Heparinized Saline	SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD		prevent the formation of thrombosis
Isoflurane	RWD life Science Co.		anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia
Penicillin-Streptomycin	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0222	antibiotics in vitro to prevent microbial contamination
Peristaltic Pump	Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd.	BT100-1L
Phosphate-Buffered Saline	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	4481228	phosphoric acid buffer salt solution
Silicone Tube	Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd.	2.4×0.8mm
Silk Suture	Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory	6-0 and 3-0	ligate blood vessels
Sodium Dodecyl Sulfate	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	151-21-3	ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes
Syringe Pump	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	BeneFusion SP5	intravenous infusion
Triton X-100	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	9002-93-1	non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions
Venous Catheter	B. Braun Company	24G	inserting the spleen artery