在体外溶栓模型中跟踪剪切流下钱德勒环形成的全血凝块的纤维蛋白溶解

摘要

体外 溶栓测定通常难以复制 体内 条件，无论是在正在消化的模型血栓中还是在发生溶栓的环境中。在此，我们探讨了如何将钱德勒环和实时荧光流动纤维蛋白溶解测定 （RT-FluFF） 偶联用于高保真、 离体、凝块溶解监测。

摘要

血栓栓塞和相关并发症是全球发病和死亡的主要原因，并且已经开发了各种测定法来测试溶栓药物 在体外 和 体内的效率。由于与动物模型相关的复杂性和成本，以及它们通常缺乏对人类生理学的可转化性，因此对用于药物开发的更具生理相关性的 体外 凝块模型的需求越来越大。流量、压力和剪切速率是循环系统的重要特征，在流动下形成的凝块与静态形成的凝块表现出不同的形态和消化特性。这些因素在传统的 体外 凝块消化测定中通常没有得到体现，这可能具有影响药物转化成功率的药理学意义。

Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis （RT-FluFF） 测定被开发为一种高保真溶栓检测平台，它使用在剪切流下形成的荧光标记凝块，然后在存在或不存在纤溶药物制剂的情况下使用循环血浆进行消化。通过改变血栓形成和血栓消化步骤的流速，系统可以在高度多样化的实验设置中模拟动脉、肺部和静脉状况。可以使用在线荧光计连续进行测量，也可以通过获取离散时间点以及传统的终点凝块质量测量进行测量。RT-FluFF 检测是一种灵活的系统，允许在更准确地代表体内生理条件的流动条件下实时跟踪凝块消化，同时保持体外检测系统的控制和可重复性。

引言

从根本上说，由血栓栓塞病因引起的疾病是当今社会发病和死亡的主要来源。血栓栓塞发病机制的表现包括但不限于心肌梗死、缺血性卒中、深静脉血栓形成和肺栓塞¹。正在进行的大量研究，跨越多个学科，围绕着开发安全有效的方法来处理致病性血栓形成。血栓形成的动脉和静脉表现的差异以及不同的解剖位置导致了不同治疗方法的发展。然而，急性治疗通常依赖于通过纤溶酶原激活剂进行药物溶栓，在某些临床情况下有可能进行机械血栓切除术²。

新型药物治疗策略的开发从根本上依赖于体内动物模型和用于临床前测试的体外消化模型 ^3,4。体内模型自然受益于它们能够捕捉各种生理参数对治疗效果的复杂相互作用，包括药物的清除以及细胞与药物的相互作用。然而，这种相同的复杂性往往使此类模型相当昂贵，并且在试图分离与人类生理学显着不同的动物的潜在药效学/动力学时，会带来额外的问题。体外模型的发展有助于促进蒸馏测试环境，在该环境中可以进行药物开发和筛选，但通常缺乏概括所研究疾病状态所需的保真度。

通常发现的用于测试新型溶栓剂的体外方案依赖于利用在静态条件下形成和裂解的凝块，其中残留的凝....

研究方案

下面提到的所有方法均符合机构审查委员会 （IRB） 协议和机构人类研究伦理委员会。所有健康志愿者在献血前都提供了书面和知情同意书。值得注意的是，协议中引用的所有材料都可以在 材料表中找到。虽然在整个协议中讨论了人WB和血浆，但可以购买和替代研究动物血液和因子耗尽的血液制品的使用。

1. 全血采集

1. 使用标准放血技术从同意的健康志愿者那里收集静脉全血 （WB）。
   注意：确保在整个协议中遵循通用预防措施，以降低与血液或其他潜在传染性物质接触的风险。使用手套、实验室外套和面罩是必要的。
2. 将 ~50 mL WB 直接收集到 3.2% 柠檬酸钠管中，并立即混合到 50 mL 管中以供后续使用。
   注意：除了确保将血液收集到柠檬酸盐管中外，还需要丢弃管子以填充到制造商推荐的体积。新鲜收集的 WB 将最好地概括宿主的凝血动力学。WB在室温下（使用前≤4小时）短期储存是允许的。WB 不会储存过夜，因为当通过血栓弹力图检查时，这已被证明会影响凝血动力学¹⁵。

2. 血栓形成

1. 加入 3 mL 柠檬酸全血中，加入荧光（荧光素异硫氰酸酯 [FITC]） 标记的纤维蛋白原 （FITC-Fg） 至终浓度为 60 μg/mL....

讨论

凝块形成和标记
钱德勒环已被证明提供了一种简单有效的方法，可以可重复生成模拟 体内 血栓¹⁶ 的凝块。通过微调管道尺寸、转速、转鼓直径和凝血时间等参数，可以在不同的剪切条件下快速生成凝块，从而捕获在模拟动脉和静脉源的血栓范围内所欣赏的结构特征。正如我们在 RT-FluFF 系统中所展示的那样，能够引入 FITC-Fg 等标记物的额外灵活性扩大了这?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,