通过纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速分离和展示 Sipunculus nudus 中的活性纤维蛋白原溶解剂

摘要

在这里，我们提出了一种纤维蛋白原 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 方案，以快速分离和显示 Sipunculus nudus 的纤维蛋白原溶解剂。

摘要

能直接溶解纤维蛋白原的纤维蛋白原溶解剂已广泛用于抗凝治疗。通常，鉴定新的纤维蛋白原溶解剂需要首先分离每种成分，然后检查它们的纤维蛋白原溶解活性。目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 和色谱法主要用于分离阶段。同时，通常采用基于纤维蛋白原板测定和反应产物的 PAGE 来显示其纤维蛋白原溶解活性。然而，由于这两个阶段的时空分离，不可能用相同的凝胶分离和显示活性纤维蛋白原溶解剂。为了简化纤维蛋白原溶解剂鉴定的分离和显示过程，我们构建了一种新的纤维蛋白原-PAGE 方法，以快速分离和展示花生蠕虫 （Sipunculus nudus） 的纤维蛋白原溶解剂。该方法包括纤维蛋白原-PAGE 制备、电泳、复性、孵育、染色和脱色。可以同时检测蛋白质的纤维蛋白原溶解活性和分子量。根据该方法，我们在 6 小时内成功检测到不止一种活性溶栓剂的花生蠕虫匀浆。此外，这种纤维蛋白原-PAGE 方法时间和成本都很友好。此外，该方法可用于研究其他生物体的纤维蛋白溶解剂。

引言

近年来，由于血栓性疾病的持续上升，血栓性疾病已成为新的全球重大健康问题¹。目前，抗血栓药物分为三类：抗血小板聚集药物、抗凝血药和溶栓药物。其中，溶栓药物，如尿激酶（UK）、组织纤溶酶原激活剂（tPA）等，是临床上唯一能水解血栓²的药物。同时，通过鉴定新型溶栓剂，正在开发更安全有效的溶栓药物³。

然而，新型溶栓剂的鉴定既费时又费力，主要涉及分离/纯化和表征/检查阶段。前者是分离每个成分，后者是显示它们的纤维蛋白（基因）溶解活性 ^4,5。在以前的研究中，尽管我们已经通过亲和色谱和纤维蛋白（原）板测定成功地从花生蠕虫 （Sipunculus nudus） 中分离出一种新的纤维蛋白（基因）溶解酶 （sFE） ^6,7,8，^但这些过程非常耗时和耗力。首先，有必要通过纤维蛋白（原）板法和基于 PAGE⁹ 的反应产物确....

研究方案

1. 花生蠕虫匀浆制备

1. 将 50 g 花生蠕虫和 150 mL 盐水溶液加入均质器中。
2. 以 24000 rpm 匀浆 60 秒。
   注意：重复 3 次。
3. 将匀浆在 4 °C 下以 9710 x g 离心 30 分钟。
4. 收集上清液作为花生蠕虫匀浆用于进一步研究。

2. 纤维蛋白原-PAGE 凝胶制备

1. 称取 0.01 g 纤维蛋白原放入 50 mL 玻璃烧杯中。
2. 将 1.9 mL DDH₂O、1.3 mL Tris-HCl（1.5 M，pH 8.8）和 0.05 mL SDS（10%，w/v）加入烧杯中;通过移液充分混合。
3. 将烧杯在37°C下放置30分钟。
   注意：此步骤是溶解纤维蛋白原。
4. 加入 1.7 mL 丙烯酰胺 （30%， w/v）、0.05 mL 过硫酸铵 （APS;10%， w/v）、0.002 mL TEMED;通过移液充分混合。
   注意：这是分离凝胶。
5. 将分离凝胶倒入 10 孔凝胶模具中。
6. 将 2 mL DDH₂O 加入凝胶模具中;等待 30 分钟。....

讨论

sFE 是我们团队之前从花生蠕虫中分离的一种新型纤维蛋白（基因）裂解酶 3,6,8,13。然而，sFE 的鉴定过程费时费力，涉及纤维蛋白原溶解活性检测、蛋白质成分分离和活性确认阶段。作为一种简单的方法，纤维蛋白原板测定法主要用于初步筛选阶段，以检查样品的纤维蛋白原?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200