通过纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速分离和展示 Sipunculus nudus 中的活性纤维蛋白原溶解剂

摘要

在这里，我们提出了一种纤维蛋白原 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 方案，以快速分离和显示 Sipunculus nudus 的纤维蛋白原溶解剂。

摘要

能直接溶解纤维蛋白原的纤维蛋白原溶解剂已广泛用于抗凝治疗。通常，鉴定新的纤维蛋白原溶解剂需要首先分离每种成分，然后检查它们的纤维蛋白原溶解活性。目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 和色谱法主要用于分离阶段。同时，通常采用基于纤维蛋白原板测定和反应产物的 PAGE 来显示其纤维蛋白原溶解活性。然而，由于这两个阶段的时空分离，不可能用相同的凝胶分离和显示活性纤维蛋白原溶解剂。为了简化纤维蛋白原溶解剂鉴定的分离和显示过程，我们构建了一种新的纤维蛋白原-PAGE 方法，以快速分离和展示花生蠕虫 （Sipunculus nudus） 的纤维蛋白原溶解剂。该方法包括纤维蛋白原-PAGE 制备、电泳、复性、孵育、染色和脱色。可以同时检测蛋白质的纤维蛋白原溶解活性和分子量。根据该方法，我们在 6 小时内成功检测到不止一种活性溶栓剂的花生蠕虫匀浆。此外，这种纤维蛋白原-PAGE 方法时间和成本都很友好。此外，该方法可用于研究其他生物体的纤维蛋白溶解剂。

引言

近年来，由于血栓性疾病的持续上升，血栓性疾病已成为新的全球重大健康问题¹。目前，抗血栓药物分为三类：抗血小板聚集药物、抗凝血药和溶栓药物。其中，溶栓药物，如尿激酶（UK）、组织纤溶酶原激活剂（tPA）等，是临床上唯一能水解血栓²的药物。同时，通过鉴定新型溶栓剂，正在开发更安全有效的溶栓药物³。

然而，新型溶栓剂的鉴定既费时又费力，主要涉及分离/纯化和表征/检查阶段。前者是分离每个成分，后者是显示它们的纤维蛋白（基因）溶解活性 ^4,5。在以前的研究中，尽管我们已经通过亲和色谱和纤维蛋白（原）板测定成功地从花生蠕虫 （Sipunculus nudus） 中分离出一种新的纤维蛋白（基因）溶解酶 （sFE） ^6,7,8，^但这些过程非常耗时和耗力。首先，有必要通过纤维蛋白（原）板法和基于 PAGE⁹ 的反应产物确定花生蠕虫匀浆是否具有纤维蛋白（基因）溶解活性。然后，必须进行一系列的层析，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等方法，进行分离纯化^10,11。随后，再次进行纤维蛋白板测定以检查每个分离组分的纤维蛋白原溶解活性。最后，进行天然 PAGE 和十二烷基硫酸钠 （SDS）-PAGE 以确定活性纤维蛋白原溶解剂的分子量¹²。因此，快速分离和显示活性纤维蛋白原溶解剂至关重要。

为了快速分离和显示花生蠕虫匀浆中的活性纤维蛋白原溶解剂，通过结合 PAGE 和纤维蛋白原板方法开发了一种新的纤维蛋白原-PAGE 方法，即将纤维蛋白原溶解剂的底物添加到天然 PAGE 凝胶中。在 non-PAGE 后，按其分子量分离组分。同时，每个活性纤维蛋白溶解成分都可以通过染色来显示。通过这种方法，我们在 6 小时内成功检测到花生蠕虫匀浆的多种活性纤维蛋白溶解剂。此外，这种纤维蛋白原-PAGE 方法时间和成本都很友好。此外，该方法可用于研究其他生物体的纤维蛋白溶解剂。

研究方案

1. 花生蠕虫匀浆制备

1. 将 50 g 花生蠕虫和 150 mL 盐水溶液加入均质器中。
2. 以 24000 rpm 匀浆 60 秒。
   注意：重复 3 次。
3. 将匀浆在 4 °C 下以 9710 x g 离心 30 分钟。
4. 收集上清液作为花生蠕虫匀浆用于进一步研究。

2. 纤维蛋白原-PAGE 凝胶制备

1. 称取 0.01 g 纤维蛋白原放入 50 mL 玻璃烧杯中。
2. 将 1.9 mL DDH₂O、1.3 mL Tris-HCl（1.5 M，pH 8.8）和 0.05 mL SDS（10%，w/v）加入烧杯中;通过移液充分混合。
3. 将烧杯在37°C下放置30分钟。
   注意：此步骤是溶解纤维蛋白原。
4. 加入 1.7 mL 丙烯酰胺 （30%， w/v）、0.05 mL 过硫酸铵 （APS;10%， w/v）、0.002 mL TEMED;通过移液充分混合。
   注意：这是分离凝胶。
5. 将分离凝胶倒入 10 孔凝胶模具中。
6. 将 2 mL DDH₂O 加入凝胶模具中;等待 30 分钟。
7. 将模具倒置，彻底除去水分。
8. 将 1.4 mL DDH₂O、0.25 mL Tris-HCl（1.0 M，pH 6.8）、0.02 mL SDS（10%，w/v）、0.33 mL 丙烯酰胺（30%，w/v）、0.02 mL APS（10%，w/v）、0.002 mL 四甲基乙二胺 （TEMED） 加入烧杯中;通过移液充分混合。
   注意：这是上样凝胶。
9. 将加载凝胶倒入与步骤 2.5 相同的凝胶模具中;立即插入梳子。
   注：此处使用的纤维蛋白原-PAGE 凝胶由含有分离凝胶和上样凝胶的纤维蛋白原 （0.2%） 组成。纤维蛋白原的浓度可根据需要进行调整。

3. 电泳

1. 将制备好的纤维蛋白原-PAGE 凝胶与胶模一起放入电泳槽中;将 1300 mL 电泳溶液（1.963 g Tris、12.22 g 甘氨酸、0.65 g SDS 和 1300 mL DDH₂O）倒入槽中;取出梳子。
2. 向 20 μL sFE 和 20 μL 花生蠕虫匀浆中加入 5 μL 5x 非变性上样缓冲液;通过移液充分混合;将它们加载到准备好的纤维蛋白原-PAGE 凝胶中。
   注意：不要将混合物煮沸。sFE 是先前鉴定的纤维蛋白（基因）裂解酶 ^6,7,8，^在本研究中用作阳性对照。花生蠕虫匀浆是要检测的样品。不含溴酚蓝、β-巯基乙醇和 SDS 的非变性上样缓冲液与 SDS-PAGE 上样缓冲液的比较。每个样品泳道用 1x SDS-PAGE 上样缓冲液分离，以清楚地检测蛋白质的运动。
3. 在 80 V 下进行电泳 30 分钟，或 120 V 下进行 20 分钟。
4. 从胶模中取出纤维蛋白原-PAGE 凝胶。

4. 复性

1. 将纤维蛋白原-PAGE 凝胶转移到塑料盒中。
2. 向盒子中加入 100 mL Tris-HCl（0.05 M，pH 7.4）和 2 mL Triton X-100。将其以 60-70 rpm 的速度放在振荡器上 10 分钟。
3. 通过移液去除洗涤缓冲液。
   注意：重复 3 次。

5. 孵化

1. 将 50 mL Tris-HCl （0.05 M，pH 7.4） 加入塑料盒中。
2. 在 37 °C 下孵育 4 小时。
   注：孵育时间可根据纤维蛋白原溶解活性的强度进行调整。

6. 染色

1. 通过移液去除孵育缓冲液。
2. 将 50 mL 考马斯 Brillant Blue 染色溶液加入盒子中，并将盒子以 60-70 rpm 的速度放在摇床上 30 分钟。

7. 脱色

1. 通过移液去除染色溶液。
2. 将 50 mL 的 DDH₂O 加入盒子中。
3. 将盒子放在振荡器上以 60-70 rpm 的速度放置 30 分钟。
   注：此处使用 DD H₂O 作为脱色溶液。振荡时间可根据纤溶活性的强度进行调整。

结果

电泳后，标记物的所有条带都清晰显示。1x SDS-PAGE 上样泳道仅显示 10 kDa 条带（溴酚蓝）。sFE 和花生蠕虫样品未显示任何可观察到的条带（图 1）。虽然样品的条带不可见，但标记物和溴酚蓝的性能表明电泳成功，并且根据样品的分子量分离样品。

虽然整个凝胶因染色而变成蓝色，但脱色使纤维蛋白原被纤维蛋白原溶解剂降解?...

讨论

sFE 是我们团队之前从花生蠕虫中分离的一种新型纤维蛋白（基因）裂解酶 3,6,8,13。然而，sFE 的鉴定过程费时费力，涉及纤维蛋白原溶解活性检测、蛋白质成分分离和活性确认阶段。作为一种简单的方法，纤维蛋白原板测定法主要用于初步筛选阶段，以检查样品的纤维蛋白原?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200