通过封装无细胞表达系统重建细菌谷氨酸受体通道

摘要

该协议描述了用于在巨大的单层囊泡（GUV）内封装无细胞表达（CFE）系统的倒置乳液方法，用于研究模型膜蛋白的合成和掺入脂质双层。

摘要

无细胞表达 （CFE） 系统是合成生物学中的强大工具，允许在合成细胞中进行细胞功能的仿生，如生物传感和能量再生。然而，重建广泛的细胞过程需要成功地将膜蛋白重建到合成细胞的膜中。虽然可溶性蛋白的表达通常在常见的CFE系统中是成功的，但合成细胞脂质双层中膜蛋白的重建已被证明具有挑战性。本文展示了一种在巨型单层囊泡（GUV）中重建模型膜蛋白（细菌谷氨酸受体（GluR0）作为模型合成细胞的方法，该方法基于在合成细胞内封装和孵育CFE反应。利用该平台，证明了用蛋白视紫红质信号肽替换GluR0的N端信号肽对GluR0成功共翻译转位到杂交GUVs膜中的作用。该方法提供了一种稳健的程序，允许在合成细胞中无细胞重建各种膜蛋白。

引言

在过去十年中，自下而上的合成生物学作为一个新兴领域越来越受到关注，在生物工程、药物递送和^{再生医学中}具有许多潜在应用^1,2。特别是，由于合成细胞的前景广阔的应用以及其促进体外生物物理研究的类细胞物理和生化特性，合成细胞作为自下而上的合成生物学的基石的发展吸引了广泛的科学界 3,4,5,6 .合成细胞通常被设计在细胞大小的巨型单层囊泡 （GUV） 中，其中重建了不同的生物过程。细胞骨架的重建 ^7,8、光依赖性能量再生⁹、细胞通讯^10,11 和生物传感¹² 是在合成细胞中重建细胞样行为的例子。

虽然一些细胞过程依赖于可溶性蛋白质，但天然细胞的许多特性，如感应和通信，通常....

研究方案

用于本研究的试剂和设备在 材料表中提供。

1. 存在小单层囊泡 （SUV） 的本体 CFE 反应

1. SUV的准备工作
   注意：此步骤需要按照使用氯仿的安全说明在通风橱中执行。
   1. 通过转移 76 μL 溶解在氯仿中的 25 mg/mL POPC 储备溶液，在玻璃小瓶中制备 5 mM 1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱 （POPC） SUV。
   2. 在轻轻旋转玻璃瓶的同时，将一股温和的氩气吹入玻璃瓶中，在底部形成一层干燥脂质膜。接下来，将玻璃瓶转移到干燥器中，其盖子松动以蒸发多余的氯仿。
   3. 将玻璃瓶保持在干燥器中1小时。然后，加入 0.5 mL 超纯去离子水以溶解脂质膜并涡旋约 2 分钟。
   4. 通过将两个过滤器支架浸泡在去离子水中并将它们放置在每个内部膜支架上来设置微型挤出装置。然后，浸泡一个 100 nm 的聚碳酸酯过滤器，并将其放置在由挤出机外壳和固定螺母固定在一起的两个内部膜支架之间。将此设置放在挤出机支架中。
   5. 用超纯去离子水冲洗两个 1 mL 气密注射器 3 次。
   6. 将脂质水混合物样品装入其中一个 1 mL 气密注射器中，并使用摆臂夹将其放置在小型挤出机的一端，以将注射器固定到位。将第二个注射器插入微型挤出机的另一端，并确保其完全凹陷。
      注意：当用脂质水混合物装....

讨论

实际上，任何依赖于分子或信息在细胞膜上转移的细胞过程，如细胞信号传导或细胞兴奋，都需要膜蛋白。因此，膜蛋白的重组成为实现不同应用的各种合成细胞设计的主要瓶颈。传统的去垢剂介导的生物膜中膜蛋白重建需要 GUV 生成方法，例如温和溶胀或电形成。溶胀方法通常产生小尺寸的囊泡，当复杂的溶液（在产生合成细胞时通常出现这种情况）被封装时，电形成产量显着下降

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600