具有间质血流的侵袭性胶质瘤微环境的光聚合透明质酸-胶原蛋白模型

摘要

我们提出了一种在侵袭性前部复制胶质瘤肿瘤微环境的方法，该方法结合了间质液流动。该模型是组织培养插入物中的透明质酸-胶原蛋白 I 水凝胶，其中可以应用流体压力头。侵袭可以定量，细胞可以分离或裂解。

摘要

胶质母细胞瘤复发是治疗成功的主要障碍，其驱动力是胶质瘤干细胞 （GSC） 侵入无法手术切除且对现有化疗耐药的健康组织。组织水平的液体运动或间质液流动 （IFF） 以依赖于肿瘤微环境 （TME） 的方式调节 GSC 侵袭，这突出了对同时包含 IFF 和 TME 的模型系统的需求。我们提出了一种在胶质母细胞瘤中复制侵袭性 TME 的可行方法：由人 GSC、星形胶质细胞和小胶质细胞接种在组织培养插入物中的透明质酸-胶原蛋白 I 水凝胶组成。升高的 IFF 可以通过将流体压力头施加到水凝胶上来表示。此外，该模型可以进行调整，以复制患者之间或患者内部的细胞比率、流速或基质刚度的差异。侵袭可以量化，而凝胶可以收获以获得各种结果，包括 GSC 侵袭、流式细胞术、蛋白质或 RNA 提取或成像。

引言

胶质母细胞瘤是一种毁灭性的疾病，其特征是生存期短¹，仅通过临床可用的治疗方法适度延长 ^2,3。这种有效治疗的障碍主要是由于化疗耐药神经胶质瘤干细胞 （GSC） 的高度浸润性造成的，这些细胞无法切除并植入复发性肿瘤⁴。同时，GSC 具有高度可塑性，对肿瘤微环境 （TME） 中的各种刺激做出反应，以便生存和侵袭 ^5,6。具体来说，密集的肿瘤和渗漏的脉管系统在肿瘤边界产生陡峭的压力差，增加与 GSC 侵袭相关的不同区域的间质液流 （IFF）⁷。这种增加的 IFF 影响 ^8,9,10，并且通常通过适合药理学抑制的分子途径增强 ^8,9 GSC 侵袭。然而，这个过程被 TME 中神经胶质细胞对神经胶质瘤....

研究方案

该协议是根据弗吉尼亚理工大学机构生物安全委员会制定的指导方针制定的。

注：除非另有说明，否则请在 BSL-2 细胞培养柜中执行所有程序。请咨询该机构的生物安全委员会，以获取有关使用人体细胞的指导。

1. 凝胶制备的计算

1. 计算实验所需的条件数。
   注：“条件”由溶液的内容物（例如，细胞浓度、胶原蛋白浓度等）定义，而不是外部应用的变量，如本例中使用的流体压力头。
2. 计算每种条件溶液所需的凝胶总体积。
   注：使用 12 mm 直径组织培养小室的 12 孔凝胶所需的体积为每小室 100-150 μL。定量侵袭时，建议至少进行 3 次技术重复。此外，为了解决移液错误造成的体积损失，请向每个条件溶液中添加额外的重复体积。
3. 从步骤 1.2 计算实验所需的凝胶溶液总体积。
4. 计算实验所需的 3 mg/mL 胶原蛋白溶液的总体积。向该体积中添加至少 10% 以解决移液时的体积损失。
   总体积 3 mg/mL 胶原蛋白 = 0.4 × 凝胶溶液总体积
5. 计算 3 mg/mL 胶原蛋白溶液中每种成分在给定最终浓度 （c_f） 下的高浓度大鼠尾部胶原蛋白 I、无菌 1 N NaOH、无菌 10x PBS....

讨论

组装 TME 模型包括六个基本步骤：1） 在类似条件下传代细胞和分离细胞，2） 组装适用于所有条件的浓缩胶原蛋白溶液，3） 为每种条件组合凝胶成分（细胞、胶原蛋白、甲基丙烯酸透明质酸和光引发剂） 4） 电镀凝胶，5） 通过紫外线照射和加热交联，以及 6） 添加流体压力头。18 小时或更长时间后，可以收获凝胶用于流式细胞术、RNA 提取、蛋白质提取、成像或其他下?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Well Tissue Culture Plate, Sterile	Celltreat Scientific Products	229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, Sterile	DOT Scientific	667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA	Thorlabs	M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, Sterile	Celltreat Scientific Products	229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm Diameter	Millicell	PI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Ethanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)	ScienCell Research Laboratories	1801	Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin.
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12587010
BSA (MACS)	Miltenyi Biotec	130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)	Fisher Scientific	25-0719-41
Cell Counting Chambered Slides	Nexcelom Bioscience	CHT4-PD100-002
Cell Scrapers	Biologix USA	70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)	VWR	NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-Speed	Eppendorf	5702 R	Centrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, Corning	Fisher Scientific	07-200-108	V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)	Thermo Fisher Scientific	50116047
Collagen I, High Concentration, Rat Tail	Corning	354249
Collagen I, Rat Tail	Corning	354236	"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)	United States Biological	C7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nm	Thorlabs	COP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips	Amazon	B01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7)	United States Biological	D3760
DMEM, high glucose (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11330032
EVOS FL	Invitrogen	AMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	26140079	For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich)	Millipore Sigma	HT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	00-5523-00
Glioma stem cells	n/a	n/a	Can be patient derived or commercial glioma stem cell lines.
Guava easyCyte HT System	Millipore Sigma	0500-4008	Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich)	Millipore Sigma	H6648
HEPES (1 M) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max	Thorlabs	DC2200	Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)	Thermo Fisher Scientific	62249
Human Astrocytes	ScienCell Research Laboratories	1800	Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	PHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERT	Applied Biological Materials	T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 position	Benchmark Scientific	H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibody	Miltenyi Biotec	130-120-420
LED UV Curing Meter	Gigahertz-Optik	X1-RCH-116	Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Advanced Biomatrix	5269-100MG	Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)	Advanced Biomatrix	5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)	Fisher Scientific	75-997-203	Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & Mg	Quality Biological	119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)	VWR	97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)	Fisher Scientific	SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25200056
ViaStain AOPI Staining Solution	Nexcelom Bioscience	CS2-0106