使用预混和冻干试剂进行基于 CRISPR 的即时诊断

摘要

在这里，我们介绍了基于预混、冻干重组酶等温扩增和基于成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 的反应的逐步制备，这些反应可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。

摘要

通过基于成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 的检测进行分子诊断，具有较高的诊断准确性和适用于即时护理环境的属性，例如快速获得结果的周转时间、方便简单的读数以及不需要复杂的仪器。然而，由于反应的成分众多，需要手动处理，因此在护理点进行反应可能很麻烦。在此，我们提供了一个循序渐进的优化方案，用于使用基于重组酶的等温扩增和基于 CRISPR 的试剂对疾病病原体和遗传标记物进行稳健检测，这些试剂被预混合，然后以易于储存和即用型的形式冷冻干燥。预混的冻干试剂可以再水化后立即使用，并保持高扩增和检测效率。我们还提供了一份故障排除指南，针对在制备和使用预混冻干试剂进行基于 CRISPR 的诊断时的常见问题，以使更广泛的诊断/基因检测社区更容易使用检测平台。

引言

基于 CRISPR 的核酸生物标志物检测诊断于 2017 年首次报道 1,2,3,4，^此后，已被美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的检测证明为下一代诊断，特别是用于检测严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） RNA，在多个国家 ^5,6,7,8.除了 2019 冠状病毒病 （COVID-19） 之外，这些技术已被证明可有效检测各种病毒和细菌 9,10,11,12,13、遗传病突变和缺失，并且可以用于检测蛋白质和小分子生物标志^....

研究方案

1. 冻干 RT-RPA 预混试剂的制备

1. 设备准备
   1. 准备液氮杜瓦瓶或托盘，用于反应的速冻。用液氮填充杜瓦瓶或托盘。
   2. 冻干机
      1. 检查排废管和腔室内部是否有冷凝水;如果需要，请去除水。
      2. 用 RNase 去污溶液清洁腔室内部和 1.5 mL 微量离心管金属架，然后用 70% 乙醇清洁。
      3. 关闭腔室门和真空释放阀。
      4. 打开冷冻干燥机。
      5. 手动将搁板温度设置为 -30 °C。
   3. 分子生物学设备
      1. 使用 RNase 去污溶液清洁以下物品：移液器、移液器吸头架、涡旋混合器、离心下微型离心机和永久性标记物。
      2. 用自来水清洁以下内容，然后用清洁湿巾纸擦拭：用于微量离心管的塑料架和用于冰块的泡沫盒。
      3. 用 RNase 去污溶液和 70% 乙醇清洁，制备加热块（用于溶解/再溶解三甘氨酸溶液）。然后，打开它并将温度设置为 60 °C。
2. 预混 RPA 反应的制备
   注：该配方用于 10 次反应（使用 3 个 RPA 沉淀）。
   1. 使用前检查三甘氨酸溶液中是否有沉淀物。如果有沉淀物，请在 60 °C 下孵育并在使用前充分....

讨论

该协议包含关键步骤。对于区域分离，建议使用单独的空间进行核酸提取、预混液制备（扩增前区域）、样品添加和扩增子检测（扩增后区域）。每个区域都应使用一组单独的工具和设备进行设置。不要将工具从一个区域带入另一个区域，尤其是从后扩增区域进入预扩增区域。清洁工作区域是必要的：应使用 RNase/DNase 去污溶液/3% Clorox，然后用 70% 乙醇或高压灭菌去离子?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC