光片成像揭示啮齿动物心脏的心脏结构

摘要

该协议利用先进的光片显微镜以及适应的组织透明化方法来研究啮齿动物心脏中复杂的心脏结构，为理解心脏形态发生和重塑具有巨大潜力。

摘要

光片显微镜 （LSM） 在理解心脏复杂的三维 （3D） 结构方面发挥着关键作用，为基本的心脏生理学和病理反应提供了重要的见解。在此，我们深入研究了LSM技术的开发和实施，以阐明小鼠模型中心脏的微结构。该方法将定制的 LSM 系统与组织透明化技术相结合，可减轻心脏组织内的光散射以进行体积成像。将传统的 LSM 与图像拼接和多视图反卷积方法相结合，可以捕获整个心脏。为了解决轴向分辨率和视场 （FOV） 之间固有的权衡问题，我们进一步引入了轴向扫描光片显微镜 （ASLM） 方法，以最大限度地减少离焦光并在整个传播方向上均匀地照亮心脏。同时，iDISCO等组织透明化方法增强了光的穿透力，促进了深层结构的可视化，并确保了对整个心脏心肌的全面检查。所提出的LSM与组织透明化方法的结合为研究人员解析啮齿动物心脏心脏结构提供了一个有前途的平台，为理解心脏形态发生和重塑具有巨大的潜力。

引言

心力衰竭仍然是全球死亡的主要原因，主要是由于成熟心肌细胞缺乏再生能力¹。心脏错综复杂的结构在其功能中起着至关重要的作用，并提供了对发育过程的见解。对心脏结构的深刻理解对于阐明心肌梗死后心脏形态发生和重塑的基本过程至关重要。最近的进展表明，新生小鼠可以在受伤后恢复心脏功能，而成年小鼠则缺乏这种再生能力²。这为研究小鼠模型中与结构和功能异常相关的线索奠定了基础。传统的成像方法，如共聚焦显微镜，具有技术局限性，包括穿透深度受限、点扫描方案缓慢以及长时间暴露在激光下造成的照片损伤。这些阻碍了完整心脏的全面三维 （3D） 成像。在这种情况下，光片显微镜 （LSM） 作为一种强大的解决方案出现，具有高速成像、减少光损伤和卓越的光学切片能力等优势 ^3,4,5。LSM 的独特功能使其成为一种有前途的方法，可以克服传统技术的局限性，为心脏发育和重塑过程提供前所未有的见解 ^6,7,8。

在该协议中，我们引入了一种成像策略，该策略将先....

研究方案

动物协议和实验已在德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会 （IACUC #21-03） 的监督下获得批准和进行。本研究使用C57BL6小鼠，包括出生后第1天（P1）的新生儿和8周大的成人。男性和女性之间没有观察到差异。所有数据采集和图像后处理均使用具有研究或教育许可的开源软件或平台进行。这些资源可根据作者的合理要求提供。

1. 样品制备和组织清理（6 - 10 天）

1. 在开始组织透明化程序之前，准备组织透明化方法所需的 材料表 中的所有化学溶液。
   注意： 在通风橱中执行所有程序，同时穿戴适当的个人防护设备，尤其是在处理有毒化学品时。
2. 通过在所需的时间点（例如P1和8周）将它们置于CO₂室中，用CO₂对动物实施安乐死，以进行全心收集，并将新鲜分离的心脏在室温（RT）下浸入0.2M KCl中以停滞在舒张期¹⁶。
3. 通过将4%多聚甲醛（PFA）浸入1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在摇床上轻轻搅拌过夜来固定心脏，以保持心脏解剖结构在4°C，见 表1。
   注意：PFA 是一种有毒化学物质，应在通风橱下进行。
4. 在室温下用 1x PBS 清洗心脏 30 分钟，3 次。
   注：可选：将心脏嵌入琼脂糖凝胶中....

讨论

成像、计算和组织透明化方法的进步为广泛研究心脏结构和功能提供了无与伦比的机会。这对于使用完整的啮齿动物心脏模型加深我们对心脏形态发生和发病机制的理解具有很大的潜力。与使用类似方法对斑马鱼心脏进行体内研究相比 40,41,42,43，先进的 LSM 技术和组织透明化方法的集成使我们能够克服在对啮齿?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Agarose
Low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
Chemicals for tissue clearing
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans	Sigma-Aldrich	118184
D.E.R.™ 332	Sigma-Aldrich	31185
D.E.R.™ 736	Sigma-Aldrich	31191
Dibenzyl ether (DBE)	Sigma-Aldrich	33630
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich	216736
Methanol	Sigma-Aldrich	439193
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Fisher	47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	79383
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Software and algorithms
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
BigStitcher	Hörl et al.22
Fiji-ImageJ	Schindelin et al.20	1.54f
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body	Olympus	MVX-ZB10
10X Illumination objective	Nikon	MRH00105
1X detection objective	Olympus	MV PLAPO 1X/0.25
473nm DPSS Laser	Laserglow Technologies	LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector	National Instrument	BNC-2110
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes	Physik Instrumente	C-884.4DC
ETL	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable	Optotune	CAB-6-300
ETL Lens Driver	Optotune	EL-E-4i
Filter	Chroma	ET525/30
Filter	Chroma	ET585-40
Filter	Chroma	ET645-75
Filter wheel	Shutter Instrument	LAMBDA 10-B
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.20DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.40DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	M-403.4PD
NI multifunction I/O	National Instrument	PCIe-6363
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Stepper motor	Pololu	1474
Tube lens	Olympus	MVX-TLU