使用人类肠道类器官在单细胞转录水平上了解小肠上皮

摘要

该方案将人类肠道类器官技术与单细胞转录组学分析相结合，为以前未曾探索的肠道生物学提供了重要的见解。

摘要

单细胞转录组学彻底改变了我们对人体细胞生物学的理解。最先进的人小肠类器官培养物提供了 离体 模型系统，弥合了动物模型和临床研究之间的差距。单细胞转录组学在人肠道类器官 （HIO） 模型中的应用揭示了以前未被认识的胃肠道细胞生物学、生物化学和生理学。先进的单细胞转录组学平台使用微流控分配和条形码生成 cDNA 文库。这些条形码 cDNA 可以通过下一代测序平台轻松测序，并被各种可视化工具用于生成图谱。在这里，我们描述了以不同形式培养和区分人小肠 HIO 的方法和程序，用于从这些形式中分离活细胞，这些形式适用于单细胞转录分析平台。这些协议和程序有助于使用小肠 HIO，以加深对在各种不同环境背景下人类肠上皮细胞在转录水平上的细胞反应的理解。

引言

小肠上皮有两个不同的区域：容纳肠道干细胞 （ISC） 的隐窝和由分泌和吸收谱系的分化细胞组成的绒毛。上皮的区域特异性增加了这种复杂性，它在小肠区域之间提供了独特的功能特性。开创性工作建立了培养条件，其中人类小肠隐窝和绒毛区都可以从手术组织或组织活检中 离体 产生¹。这些培养物弥合了动物研究和临床试验之间的差距，并揭示了以前未被认识的胃肠道细胞生物学、生物化学和生理学。HIO 使用含有促进干细胞活力的生长因子和细胞外支持基质的培养基以 3D 球形结构繁殖。这些条件导致主要由祖细胞和干细胞组成的隐窝样 HIO 模型。去除生长因子促进 ISC 分化（绒毛样模型）和成熟肠上皮细胞（杯状、肠内分泌、簇状、肠上皮细胞）的产生，以及细胞增殖和分化、极化、屏障完整性、区域特异性特征和适当的生理反应².HIO 培养物在遗传上是稳定的，可以在其隐窝样状态下无限增殖。允许以单层形式生长的培养条件提供了易于进入这些培养物顶端表面^{的机会 3}。HIO 还允许在生物分析中考虑宿主个体的变异性，例如遗传、年龄、性别、种族和疾病状态。分析和功能评估工具与以转化细胞系为中心的方法中使用的工具相同，包括多种分子技术，如流式细胞术、显微镜、转录组学、蛋白质组学和代谢组学。

单细胞转录组学通过深入了解每种细胞类型对生物过程的个体贡献，正在彻底改变我们对小肠生....

研究方案

此处使用的类器官系来自德克萨斯医学中心消化疾病中心 GEMS Core。简而言之，为了最初建立类器官系，对供体组织样品进行洗涤和酶消化以释放肠隐窝。隐窝包埋在基底膜中并在培养基中培养。贝勒医学院机构审查委员会批准了获取组织样本的研究方案，从中建立类器官系，并获得所有供体的知情同意，以从捐赠组织中建立类器官系。

1. 3D HIO 的传代以扩展以进行分化

1. 用 P1000 移液管从 24 孔板（固体基底膜周围）中生长的类器官孔中取出并丢弃培养基。向孔中加入 300 μL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并使用 P1000 移液管上下移液 5 次，机械分解类器官。
2. 将板在 37 °C 下孵育 4 分钟。向每个孔中加入 500 μL 不含生长因子的完全培养基（含 10% FBS）的 CMGF-培养基（表 1）。使用 P1000 移液管和移液管 CMGF 培养基和 HIO 混合物，在孔中来回 10 次。将整个体积转移到 15 mL 试管中。将多个孔的通道合并到同一个 15 mL 管中。每管混合的孔数不要超过 10 个。
3. 使用 100 x g 的摆动转子离心机在 4 °C 下旋转细胞 5 分钟。去除所有培养基，将沉淀保持在试管底部。将试管放在冰上。
4. 计算铺板 HIO 数量所需的基底膜量，并使用冷 P200 移液器吸头将 HI....

讨论

使用单细胞基因组学平台，可以分解复杂的生物系统，例如模拟肠上皮的组织来源的 HIO 培养物，从而产生对整体生物反应的单个细胞贡献 ^4,5,6。细胞异质性和稀有细胞群也可以被识别和询问。需要优化细胞输入，以使用基于单细胞转录组学的平台最大限度地提高输出。在这里，我们描述了将产生高度活力和高质量单细胞悬液?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM