模拟疾病进展和预测药物活性的非小细胞肺癌原位异种移植模型的构建

摘要

本研究提出了一种基于荧光 A549-iRFP 细胞多细胞球体肺内接种的原位非小细胞肺癌 （NSCLC） 模型。该模型根据长波长荧光的 动态体内 监测，概括了临床 NSCLC 分期和对顺铂的反应。

摘要

非小细胞肺癌 （NSCLC） 是一种高度致命的疾病，具有复杂且异质性的肿瘤微环境。目前，基于癌细胞悬液皮下接种的常见动物模型并不能概括 NSCLC 中的肿瘤微环境。在此，我们描述了一种小鼠原位肺癌异种移植模型，该模型采用三维多细胞球 （MCS） 的肺内接种。具体来说，荧光人 NSCLC 细胞 （A549-iRFP） 在含有胶原蛋白的低附着 96 孔微孔板中培养 3 周以形成 MCS，然后将其肋间接种到无胸腺裸鼠的左肺中，以建立原位肺癌模型。

与原始 A549 细胞系相比，A549-iRFP 细胞系的 MCS 对抗癌药物的反应相似。A549-iRFP 细胞的长波长荧光信号与癌细胞生长的常见标志物（包括球体体积、细胞活力和细胞蛋白水平）密切相关，因此可以通过荧光成像动态监测 体内 癌症生长。接种到小鼠体内后，A549-iRFP MCS 异种移植物可靠地经历了与 NSCLC 临床阶段非常相似的阶段，包括原发肿瘤的扩增、邻近继发性肿瘤的出现以及癌细胞向对侧右肺和远端器官的转移。此外，该模型对基准抗肺癌药物顺铂的反应具有预期的毒性和较慢的癌症进展。因此，这种 NSCLC 的小鼠原位异种移植模型将作为一个平台来概括疾病的进展并促进潜在抗癌药物的开发。

引言

在所有肿瘤疾病中，肺癌不仅造成的生命损失最高，而且在美国每年的新患者人数也位居第二¹。这种毁灭性的恶性肿瘤是现代医疗保健的主要障碍，敦促人们更深入地了解其错综复杂的生物学和更有效的治疗方式²。非小细胞肺癌 （NSCLC） 占肺癌的 85%，并倾向于发展为实体瘤³。肺癌面临的主要挑战之一是动态和异质性的肿瘤微环境，它深刻影响癌症的进展和对治疗干预的反应 ^4,5,6。在 NSCLC 的不同阶段，更深入地了解癌细胞与其微环境之间的相互作用，需要精细的病理模型来概括 NSCLC 进展的组织学特征。

在这方面，原位动物模型成为 NSCLC 研究的一个有前途的途径。与常用的皮下异种移植模型⁷ 不同，原位模型的特点是癌细胞直接接种到起源器官中。对于肺癌，这意味着将癌细胞直接植入肺组织 ^8,9。因此，肺癌的原位模型更好地模拟了天然肿瘤微环境，包括邻近的组织、血管和免疫成分，从而提高了它们的生理和临床相关....

研究方案

动物研究是在太平洋大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准下进行的（动物协议 19R10 和 22R10）。本研究使用 8 只 5-6 周龄的雄性无胸腺裸鼠，体重 20-25 克，用参考的啮齿动物饮食饲养并在无病原体 （SPF） 条件下饲养。笼子、垫料和饮用水被高压灭菌并定期更换。小鼠体内肿瘤接种的示意图如图 1 所示。有关本协议中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

1. A549-iRFP 细胞三维 MCS 的建立

1. 在 37 °C 下用 5% CO₂ 的潮湿气氛孵育 A549-iRFP 细胞（人肺腺癌），并在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素和 1 μg/mL 嘌呤霉素的完全生长培养基 DMEM 中培养它们。
2. 使用 100 μL 补充有 0.3% 胶原蛋白的完全生长培养基，以 4,000 个细胞/孔的接种密度将 A549-iRFP 细胞接种到 96 孔超低附着度圆底球状微孔板中。
3. 将微孔板在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟，以促进 MCS 形成。在显微镜下检查 MCS 形态，以确保离心后细胞聚集。
4. 48 小时后，向每个孔中加入 100 μL 完全生长培养基，以达到每孔 200 ....

讨论

A549-iRFP MCS 的构建是一种简单且高度可重复的实验室程序，可以转化为多种细胞系的 MCS 形成。在离心和胶原蛋白的帮助下生成的 MCS 在 3-4 天内表现出更完整的实体瘤样结构。这种方法可确保形成坚固的球体，这些球体可以长时间保持其整体结构，通常为 2-3 周甚至更长时间，直到小芽开始出现。通过采用离心和胶原蛋白，我们对 MCS 的形成进行了标准化，确保了它们在我们的实验模型中的一致性?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01