基于多孔底物的电穿孔与跨上皮电阻抗监测

摘要

多孔底物电穿孔 （PSEP） 将一致、高通量的递送与高细胞活力配对。跨上皮电阻抗 （TEEI） 测量的引入提供了对 PSEP 中间过程的深入了解，并允许无标记交付。本文讨论了一种同时进行 PSEP 递送实验和 TEEI 测量分析的方法。

摘要

多孔底物电穿孔 （PSEP） 是一种新兴的电穿孔方法，可提供高通量和一致的递送。与许多其他类型的细胞内递送一样，PSEP 在很大程度上依赖于荧光标志物和荧光显微镜来确定递送是否成功。为了深入了解电穿孔过程的中间步骤，开发了一个集成了跨上皮电阻抗 （TEEI） 监测的 PSEP 平台。细胞在带有多孔膜的市售插入片段中培养。孵育 12 小时后，为了形成完全汇合的细胞单层，将插入片段置于位于 PSEP 装置孔中的转染培养基中。然后对细胞单层进行用户定义的波形，并通过荧光显微镜确认递送效率。通过脉冲和荧光显微镜之间的 TEEI 测量，可以显著增强该工作流程，以收集有关 PSEP 过程的额外数据，并且这些额外的 TEEI 数据与递送指标（如递送效率和活力）相关。本文介绍了使用 TEEI 测量执行 PSEP 的协议。

引言

电穿孔是一种将细胞暴露在电场中的技术，在细胞膜上形成临时孔，包括蛋白质、RNA 和 DNA 在内的货物可以通过该孔 ^1,2。使用最广泛的版本是体电穿孔 （BEP）。BEP 的执行方式是：在比色皿中填充含有数百万个细胞的电解质，将电解质暴露在高压下，并允许货物通过扩散或内吞作用进入细胞¹。BEP 具有许多优点，包括高通量和众多市售系统。但是，BEP 交付存在限制。相对于电极的电池位置不一致和相邻电池的电场屏蔽会导致 BEP ^3,4 期间电场暴露的显着变化。BEP 所需的高电压也对细胞活力有显著的负面影响⁵。自 2011 年问世以来⁶，人们对一种称为多孔衬底电穿孔 （PSEP） 的电穿孔方法越来越感兴趣，尽管它有时被称为其他名称，包括局部电穿孔和纳米或微电穿孔 ^1,7,8。与 BEP 的细胞悬液相比，PSEP ....

研究方案

材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 试剂和细胞培养的制备

1. 将 50 mL 胎牛血清 （FBS） 和 5 mL 青霉素-链霉素添加到 500 mL 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 容器中，制备细胞培养基。生产 11 个 50 mL 等分试样以降低污染风险，并在 4 °C 下冷藏。
2. 根据制造商的说明，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 储备液中制备 1 mL 25 μg/mL 人血浆纤连蛋白。
3. 在 DMEM 储备液中制备 15 mL 0.1 mg/mL 碘化丙啶，以允许对不同货物浓度进行实验。
4. 在含有 12 mL 制备的细胞培养基的 T75 培养瓶中培养 A431 细胞。每 1-2 天传代一次细胞以保持 50% 的汇合度。

2. 样品制备

1. 纤连蛋白涂层
   1. 选择 12 个插件和 2 个 24 孔板。将插件放入一个孔板中，形成两排，每行 6 个。将第二个孔板放在一边，直到以后。
   2. 在 1.5 mL 试管中混合 52 μL 纤连蛋白储备液和 1,248 μL PBS，制备 1,....

讨论

图 2C 表明，对于每个 PSEP 波形电压，TEEI 从最小值增加，从基线降低。TEEI 的增加会产生抛物线电弧，在降低之前达到 20 伏左右的峰值，而 TEEI 相对于基线的降低随着电压的增加呈指数增加。 图 2D 中的传输效率和死亡百分比反映了这些趋势，传输效率呈抛物线电弧，峰值约为 30 伏，并且随着波形电压的增加，死亡呈指数级增.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046