体外研究 H5N1 特异性鸭 T 细胞的培养和使用细胞内细胞因子染色法检测免疫反应

摘要

该方案描述了 一种通过从 受感染的鸭子中分离记忆 T 细胞来体外培养禽 T 细胞的方法，从而可以产生高度纯化的特异性鸭 T 细胞。此外，建立了细胞内细胞因子染色 （ICS） 方法以准确测量鸭 T 细胞中 IFN γ 的分泌。

摘要

T 细胞的 体外 培养是研究免疫反应、病毒感染和潜在治疗策略的关键方法。然而，迄今为止，尚未报道在 体外 培养禽 T 细胞的既定方案。在这项研究中，我们首次提出了一种方案，利用高致病性禽流感 （HPAIV） H5N1 病毒作为模型。在这里，4 周龄的鸭子感染了病毒，并在感染后 28 天分离记忆 T 淋巴细胞以培养 H5N1 特异性鸭 T 淋巴细胞，从而能够研究对 H5N1 病毒的特异性免疫反应。该方案中的关键步骤包括从受感染的鸭子中分离记忆外周血单核细胞 （PBMC），激活具有最佳感染复数 （MOI = 5） 的抗原呈递细胞 （APC） 6 小时，并制备补充有重组 IL-2 和其他特异性添加剂的 T 细胞培养基。在整个过程中密切监测 T 细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒活性。此外，我们建立了细胞内细胞因子染色方案来量化鸭 T 细胞中 IFN γ 的分泌。这涉及生成表达对鸭 IFN-γ 特异性 IgG3κ 抗体的杂交瘤细胞系，然后成功纯化抗体。将纯化的抗体以 1：10 稀释并应用于流式细胞术，以精确测量 IFN-γ 的分泌。该方法为评估鸭 T 细胞反应提供了可靠的工具，并为未来对禽病毒免疫学的研究奠定了基础。

引言

T 细胞活化、增殖、分化和转化为记忆 T 细胞的过程是抗原特异性免疫应答的核心¹。最初，当 T 细胞受体 （TCR） 识别主要组织相容性复合体 （MHC） 分子呈递在抗原呈递细胞 （APC） 表面的抗原肽时，T 细胞被激活 ^2,3。这种激活过程不仅需要 TCR 与 MHC 分子的结合，还需要协调共刺激信号，这对于完全激活 T 细胞功能至关重要⁴。一旦被激活，T 细胞就会迅速进入增殖期，产生许多与原始 T 细胞具有相同抗原特异性的克隆。在这个增殖阶段，T 细胞根据其功能进一步分化，主要分化为 CD8⁺ T 细胞和 CD4⁺ T 细胞⁵。这些分化的细胞分别介导细胞毒性杀伤和协助免疫反应。初次感染后，一部分活化的 T 细胞转化为长寿命记忆 T 细胞⁶。这些记忆 T 细胞可以在免疫系统中持续很长时间，在再次暴露时对相同的病原体迅速做出反应。因此，它们会产生更强、更有效的免疫反应，为宿主提供长期的免疫保护⁷。整个过程对于 T 细胞疫苗的设计至关重要，因为它有助于提高疫苗的功效和持久性⁸。

在这种情况下，在体外培养抗原特异性 T 细胞变得至关重要。该方案是基于人 T 细胞体外培养的既定方法开发的，对禽免疫系统进行了必要的适应⁹。通过在体外培养这些细胞，研究人员可以研究不同免疫状态下的 T 细胞反应，例如激活、增殖、分化和记忆形成¹⁰。这种体外方法对于了解 T 细胞在免疫反应中的作用非常宝贵。此外，在体外培养条件下，可以监测 T 细胞分泌细胞因子（如 IFN-γ）^11,12。这种监测对于评估免疫反应的质量、强度和持久性以及研究 T 细胞与其他免疫细胞之间的相互作用至关重要。此外，抗原特异性 T 细胞的体外扩增可实现大规模富集，提高检测灵敏度，并增强对 T 细胞反应水平的评估¹³。因此，抗原特异性 T 细胞的体外培养是更好地了解家禽 T 细胞在免疫反应中的作用的有力工具，从而提高了检测的灵敏度并增强了 T 细胞反应水平的评估。虽然类似的体外方法已在哺乳动物系统中得到广泛确立，但此类技术在鸟类物种中的应用仍然有限。这在家禽免疫学中尤其相关，因为分析T细胞反应的工具还不发达。尤其是鸭子，它是几种禽流感病毒的天然宿主，但人们对它们的抗原特异性 T 细胞免疫知之甚少。因此，开发针对禽类系统的标准化体外 T 细胞培养方案对于推进家禽的基础研究和应用免疫学至关重要。

参与这些过程的关键细胞因子是 IFN-γ，这是一种主要由 CD8⁺ T 细胞、1 型 CD4⁺ T 细胞和 NK 细胞产生的 II 型干扰素¹⁴。IFN-γ 在抑制病毒复制和调节免疫反应方面起着至关重要的作用¹⁵。IFN-γ 的表达水平反映了免疫状态，并作为 T 细胞活化的标志物，使研究人员能够通过其表达来评估 T 细胞反应水平^16,17。检测免疫细胞中细胞因子表达的一种常用方法是细胞内细胞因子染色 （ICS）^18,19。然而，由于实验材料和技术的限制，对鸭子的研究落后于哺乳动物⁵。目前，许多研究人员依靠 qPCR 来测量 IFN-γ 表达水平，尽管这种方法有一定的局限性¹¹。在我们的实验室中，我们成功开发了一种与流式细胞术兼容的鸭 IFN-γ 抗体。基于这一成功，在这项研究中，我们建立了一种 ICS 方法来检测鸭 T 细胞中 IFN-γ 蛋白的表达，为进一步研究鸭 T 细胞反应提供了可靠的工具。

研究方案

根据华南农业大学 （CNAS BL0011） 的规程，所有可用的甲型禽流感 （H5N1） 病毒的所有实验均在动物生物安全 3 级实验室和动物设施中进行。所有动物研究项目均获得华南农业大学机构动物护理与使用委员会（识别码 2021f154,2021 年 7 月 29 日）批准。所有动物程序均根据该委员会制定的法规和指南以及动物福利国际标准进行。本研究中使用的动物是 4 周龄的家养绿头鸭 （Anas platyrhynchos domestica），包括雄性和雌性，体重从 500 到 600 克不等。

1. 鸭 PBMC 的分离和单细胞悬液的制备

1. 从每只鸭子的颈静脉收集 2 mL 肝素化血液，并转移到含有 EDTA 的试管中，以防止每只鸭子凝结
2. 使用淋巴细胞分离试剂盒或 PBS 中提供的样品稀释剂稀释血液。用巴斯德移液器移液轻轻混合。血液与稀释剂的通常稀释比为 1：1。
3. 将等体积的淋巴细胞分离溶液作为稀释的血液转移到离心管中。小心地将血液悬浮液铺在淋巴细胞分离溶液的顶部。将混合物在 400 x g 、25 °C 下离心 15 分钟，将下降加速度设置为 1。
   注：淋巴细胞分离液的量不应少于 4 mL。淋巴细胞分离溶液试剂盒的组分可在 材料表中找到。
4. 离心后，从上到下观察离心管中的四个不同层。顶层是样品稀释剂，然后是环形乳白色淋巴细胞层，然后是分离液，底层由红细胞组成。
5. 小心地使用移液管收集第二层，即环形乳白色淋巴细胞层，并将其转移到新的离心管中。加入 10 mL 清洁溶液以与细胞混合。
6. 在室温下以 440 x g 离心样品 5 分钟。弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于 10 mL RPMI 1640 培养基中用于细胞计数。
7. 可选）为了进一步纯化样品，在 440 x g 离心 5 分钟后，使用红细胞裂解缓冲液去除任何残留的混合血细胞。

2. 体外 H5N1 AIV 特异性 T 细胞培养

1. 从养鸭场购买 2 周龄的健康绿头鸭 （Sheldrake），并将它们饲养在负压隔离器中。在实验前通过使用血凝抑制 （HI） 测定确认鸭子的 AIV 阴性。用 H5N1 AIV 1 x 10⁶ 感染 4 周龄鸭，鼻内注射 50% 鸡蛋感染剂量 [EID50]/0.2 mL。
2. 按照步骤 1 中描述的方法，在感染后 28 天从 H5N1 感染的鸭子中分离记忆 PBMC。使用血细胞计数器计数细胞。用 0.08% 台盼蓝以 1：1 的比例稀释细胞悬液，并在光学显微镜下手动计数活细胞（未染色）。
   注意：正如我们之前发表的研究²⁰ 所支持的那样，感染后 28 天分离的外周血单核细胞 （PBMC） 被认为富含记忆 T 细胞。在这个阶段，效应期已经消退，记忆细胞群占主导地位。
3. 将浓度设置为 3 x 10⁶ 个细胞/mL，确保向 48 孔板的每个孔中加入 1 mL 培养基。
4. 用 H5N1 禽流感病毒 （AIV） 共同感染分离的 PBMC 以用作 APC。病毒剂量为 MOI = 5。将 PBMC 与病毒在 37 °C 下共培养 1 小时。 每 15 分钟用手轻轻摇晃一次。
5. 感染 1 小时后，用 PBS 洗涤细胞 2 次以去除未结合的病毒颗粒。将洗涤后的 PBMC 重悬于 1 mL T 细胞培养基中，并将悬浮细胞在 37 °C 下进一步孵育 5 小时。
6. 在室温下以 440 x g 离心细胞 5 分钟。然后，将孵育的抗原呈递细胞 （APC） 重悬于 100 μL T 细胞培养基中，并将其添加到效应细胞中。抗原呈递细胞与效应细胞的比例应为 1：5。
7. 将细胞在 37 °C 的 5% CO₂ 气氛中孵育 14 天。每 2 天，小心移液，用新鲜的 T 细胞培养基替换一半的细胞培养上清液，以确保分布均匀。丢弃一半含有细胞的培养基，然后加入等体积的新培养基。
8. 第 7 天，在光学显微镜下以 100 倍观察细胞。
9. 使用 PBS 处理的记忆 PBMC 作为未刺激的对照组。

3. 羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯 （CFSE） 监测 T 细胞增殖

1. 将细胞密度调节至 0.5-1 x 10⁷ 个细胞/mL，并在以 440 x g 离心 5 分钟后用 5 mL PBS 重悬细胞。
2. 用 5 mL 预冷 PBS 将 10 mM 原液稀释至 1 μM CFSE;在黑暗中作。
3. 将两个离心管倾斜 45°，用巴斯德移液管将 CFSE 稀释液加入细胞悬液中，充分混合，并在 37 °C 水浴中避光放置 15 分钟。
4. 通过在 10 体积的含有 5% FBS 的预冷 PBS 中稀释细胞来洗涤细胞，以 440 x g 离心沉淀 5 分钟，然后弃去上清液。重复洗涤 2 次。
5. 按照第 2 步 在体外 刺激用 CFSE 标记的细胞。增殖测定完成后，收获细胞并通过流式细胞术进行分析。

4. 流式细胞术分析 CD8⁺ T 和 CD4⁺ T 细胞的增殖

1. 培养 7 天后，从每个孔中收集所有细胞，并将它们分成两个流管进行分析。
2. 将细胞转移到新的离心管中，在室温下以 440 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
3. 加入 100 μL 抗体混合物（小鼠抗鸭 CD8,1：50 或小鼠抗鸭 CD4,1：50），并将细胞在 4 °C 的黑暗中孵育 30 分钟。
4. 将细胞转移到新的离心管中，在室温下以 440 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
5. 加入 100 μL 抗体混合物（FITC 偶联的山羊抗小鼠 IgG2b，1：50），并在 4 °C 下避光孵育细胞 30 分钟。
6. 在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟，用 1 mL PBS 洗涤细胞一次。 使用 FlowJo 软件分析数据。门控策略如 补充图 1 所示。

5. 使用 qPCR 通过特征基因表达测定获得 T 细胞反应

1. 在 T 细胞培养结束时对细胞进行计数，收集在 1.5 mL 离心管中，并以 400 x g 离心 5 分钟。小心丢弃上清液。
2. RNA 提取
   注：可以在通风橱或超净工作台中进行提取，以防止 RNA 污染。
   1. 按照制造商的说明，使用试剂盒中提供的裂解缓冲液裂解细胞。将裂解的样品转移到 gDNA 过滤柱中（预先放入收集管中），以 13,400 x g 离心 30 秒，弃去色谱柱，并收集滤液。向滤液中加入 0.5 体积的无水乙醇。充分混合。
      注：加入乙醇后出现混浊溶液或沉淀物是正常的。摇动并继续下一步。
   2. 将混合物转移到 RNA 柱中，以 13,400 x g 离心 30 秒。弃去滤液，加入 700 μL 缓冲液 RW1，然后再次离心。
   3. 弃去滤液，加入 700 μL 缓冲液 RW2（含无水乙醇），然后离心。弃去滤液，加入 500 μL 缓冲液 RW2（含无水乙醇），离心 2 分钟。小心地从试管中取出色谱柱，以避免滤液污染。确保去除所有冲洗液，以防止干扰下游反应。
   4. 将色谱柱转移到新的无 RNase 收集管中，加入 50-200 μL 不含 RNase 的 ddH₂O，在室温下静置 1 分钟，然后以 13,400 x g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。测量 RNA 纯度和浓度。
      注：将不含 RNase 的 ddH₂O 预热至 65 °C 以提高产量，并在需要时进行第二次洗脱。
3. 按照试剂盒说明合成 cDNA。按照制造商的说明合成 cDNA 链，添加 5 倍量的逆转录酶。在 37 °C 下逆转录 15 分钟，然后在 85 °C 下 5 秒，然后冷却至 4 °C。
4. 根据制造商的方案设置 PCR 反应。
   1. 在 qPCR 管中，混合 10 μL 2x PCR 反应酶混合物、0.4 μL 引物 1、0.4 μL 引物 2、1 μL cDNA 模板和 8.2 μL ddH₂O，制成 20 μL 混合物。
   2. 使用以下程序在实时定量 PCR 仪器中运行 PCR：
      第 1 阶段：95 °C 持续 30 秒，重复 x 1
      第 2 阶段：95 °C 持续 3 秒，60 °C 持续 30 秒，重复 x 35
      第 3 阶段：95 °C 持续 15 秒，60 °C 持续 60 秒，95 °C 持续 15 秒，重复 x 1

6. 细胞内细胞因子染色 （ICS）

注意：该方案旨在通过检测鸭细胞内 IFN-γ 分泌来评估 H5N1 特异性 CD8 ⁺ T 细胞的效应反应。

1. 按照步骤 2 中描述的程序 在体外 培养 H5N1 特异性 T 细胞。培养开始 7 天后收获所有细胞（从每个孔中）。
2. 如步骤 2 中所述孵育抗原呈递细胞 （APC）。将孵育的 APC 和 Brefeldin A （1：1,000） 添加到效应细胞中，并在 39 °C 培养箱中共孵育 6 小时。
3. 将细胞转移到新的离心管中，在室温下以 440 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
4. 向细胞中加入 100 μL 抗体混合物（小鼠抗鸭 CD8,1：50），并在 4 °C 下避光孵育 30 分钟。
5. 通过在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟来洗涤细胞，然后将它们重悬于 1 mL PBS 中。加入抗体混合物（FITC偶联的山羊抗小鼠IgG2b，1：50），并在4°C下避光孵育30分钟。
6. 通过在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟再次洗涤细胞。 弃去上清液，将细胞重悬于 100 μL 固定缓冲液中，并在 4 °C 下避光孵育 20-25 分钟。
7. 通过在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟再次洗涤细胞。 加入 1 mL 的 1x 透化缓冲液，并在 4 °C 下以 440 x g 离心 5 分钟洗涤细胞 2 次。
8. 弃去上清液，将细胞重悬于 100 μL 透化缓冲液中，并向细胞中添加抗体（小鼠抗鸭 IFN-γ，1：10）。固定和膜透化后，将细胞抗体混合物在黑暗中孵育 30 分钟，在 4 °C 下孵育期间偶尔摇晃。
   注：透化/洗涤溶液是 10x 储备溶液，使用前必须用 PBS 稀释。
9. 在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟，再次用 1 mL PBS 洗涤细胞。 加入 100 μL 抗体混合物（PE 偶联的山羊抗小鼠 IgG3,1：250），并在 4°C 避光下孵育 30 分钟。
10. 使用 FlowJo 软件分析数据。门控策略如图 1 所示。

结果

该方案是基于早期对鸭²⁰ 中抗原特异性 T 细胞效应反应检测的研究而开发的。实验的第一步涉及病毒特异性 T 细胞的 体外 培养，作为后续效应反应研究的基础。最初，将 APC 与效应细胞一起孵育和共培养。形态学观察显示，增殖后，细胞表现出簇状生长（图 2A）。CFSE 标记通过显示细胞分裂的多个峰进一步证实了成功增殖（...

讨论

该方案为鸭抗原特异性 T 细胞的 体外 培养提供了一种有效的方法，还为鸭建立了细胞内细胞因子染色方案，可用于评估 T 细胞的效应反应。目前，没有关于鸭 T 细胞 体外 培养方案的已发表报告。我们主要参考了人类抗原特异性 T 细胞的方案，但致力于优化 APC 的孵育条件。我们正在考虑进一步优化我们的分化方案。

该协议中有两个关?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL MICRO-Centrifuge tubes	Biosharp	Cat#BS-15-M
15 mL Centrifuge tubes	Labselect	Cat#CT-002-15A
2-mercaptoethanol (55 mM)	Sigma-Aldrich	Cat#M6250-100ML
48-Well tissue culture plate (No treated, flat bottom)	Biofil	Cat#TCP000048
50 mL Centrifuge tubes	Labselect	Cat#CT-002-50A
96-well Unskirted qPCR Plates	Labselect	Cat#PP-96-NS-0100
BD Cytofix/Cytoperm kit	BD Bioscience	Cat#BD 554714
Brefeldin A (BFA)	BD Bioscience	Cat#347688
Cell culture CO2 incubator	Thermo Fisher	Heracell 150i GP
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE-labeling kit	Abcam	Cat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Cat#Q341-02
Duck peripheral blood lymphocyte isolation kit	Tbdscience	Cat#LTS1090D
Evo M-MLV RT Premix	Accurate Biotechnology	Cat#AG11706
FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2	Vazyme	Cat#RC112-01
Fetal Bovine Serum	Gibco	Cat#10437-028
Flow cytometer	Beckman Coulter	BA43347
Flow Tube	Beyotime	Cat#FFC005
FlowJo v10.8.1	Tree Star	https://www.flowjo.com
Goat Anti-Mouse 488, 1:50 dilution	Abbkine	Cat#A23210
Goat Anti-Mouse IgG2b, FITC, 1:50 dilution	Southern Biotech	Cat#1091-31
Goat Anti-Mouse IgG3, PE, 1:250 dilution	Southern Biotech	Cat#1100-09S
GraphPad prism 8.0.2	GraphPad Software	https://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV strain DK383	National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicamen of Zoonosis Prevention and Control	A/Duck/Guangdong/383/2008
L-glutamine (200 mM)	Gibco	Cat#25030081
Microscope	Motic	AE2000
Mouse Anti-Duck CD4, 1:50 dilution	Bio-Rad	Cat#MCA2478
Mouse Anti-Duck CD8α, 1:50 dilution	GeneTex	Cat#GTX41834
Mouse Anti-Duck IFN-γ mAb, 1:10 dilution	Prepared in our laboratory	NA
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher	AZY1603209
NEAA (non-essential	Gibco	Cat#11140-050
PBS	Gibco	Cat#10010023
PCR Thermal Cycler	Biometra	Biometra Tone 96G
Penicillin-streptomycin solution	Gibco	Cat#15070063
Real-Time PCR system	Applied Biosystems	ABI7500
recombinant human IL-2 (10 μg)	USCNK	Cat#RPA111Ga01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Tbdscience	Cat#NH4CL2009
RPMI 1640	Gibco	Cat#11875-119
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	Cat#11360-070
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	Cat#93595
Two-week-old mallard ducks (Sheldrake)	a duck farm in Guangzhou	NA