基于免疫沉淀的技术:使用阿加玫瑰珠纯化内源性蛋白质

Overview

资料来源:苏珊娜·希斯^勒1，托尼娅·^韦伯1
¹马里兰大学巴尔的摩分校微生物学和免疫学系，MD 21201

免疫沉淀（IP，也称为"下拉"测定）是一种广泛使用的技术，在各种领域都有应用。它于1984年首次构思，1988年经过提炼（1，2）。IP 的基本目标是使用针对该蛋白质的抗体对特定蛋白质进行纯化和分离。"免疫"一词是指使用抗体，而"沉淀"一词是指从溶液中拉出特定物质。目标蛋白可能是内源性或重组蛋白。大多数重组蛋白都有一个表位标记（即myc或标志）附着在它们上，以简化随后的纯化。通常，优化重组蛋白 IP 更容易，因为针对重组表位标记的抗体非常强和有效。针对内源性蛋白质的抗体具有极其可变的疗效 - 使得优化这些 IP 更加困难。免疫沉淀后的一个必要步骤是纯化验证。分离的蛋白质使用SDS-PAGE解决，随后由西方血带探查纯度（图1）。一个重要的控制是在西方印块期间使用不同的抗体来验证正确蛋白质的提取。IP 与后续技术的结合是一种强大的分析工具。纯化后的目标可能是通过NMR、质谱和体外测定对蛋白质本身进行表征，或分析蛋白质的相互作用伙伴（即蛋白质、DNA、RNA）（3、4、5）。

图1:免疫沉淀程序概述。免疫沉淀是使用抗体分离特定蛋白质。从细胞中生产分解后，有两个主要步骤-预清除和拉下。在预清除步骤中，细胞解物预先清除使用等型对照抗体与非特定抗体结合的蛋白质。在下拉步骤中，使用蛋白质特异性抗体将目标蛋白拉下。分离的蛋白质然后由西方斑点进行分析。等型抗体和蛋白质特异性抗体具有相同的恒定域，但抗原结合域不同。该协议的一个关键成分是蛋白质A/G腺珠，它结合抗体的恒定域-允许目标蛋白的免疫沉淀。请点击此处查看此图的较大版本。

抗体是免疫沉淀的关键成分，它区别于其他形式的蛋白质纯化（即镍亲基柱纯化）。抗体是由B细胞制成的分子，可以识别特定的蛋白质表皮。抗体有两个域:常数（Fc）和抗原结合（Fab）（图1）。常量域识别抗体的类型，并指示体内的功能。通常，用于IP的抗体的恒定域是小鼠、大鼠或兔子IgG。抗体的抗原结合部分识别特定蛋白质的特定表位。抗体可以识别折叠蛋白上的缩影，当蛋白质变性时，这些蛋白质可能不存在，反之亦然。因此，表位的可用性取决于蛋白质折叠 - 识别在选择抗体和IP条件时要考虑的重要因素。

原核素和真核系统都有抗体结合蛋白。在真核系统中，目的是免疫保护细菌，而在原核系统，目的是保护免疫系统。抗体结合蛋白以两种方式影响 IP 方法。首先，有必要的预清除步骤（图1）去除结合抗体的蛋白质的解结-从而减少最终产品中的非特异性结合。此步骤使用同型抗体，其恒定域与蛋白质特异性抗体不同，但抗体结合域不同。细菌抗体结合蛋白是该方法的第二个关键成分。在蛋白质特异性抗体结合靶蛋白后，抗体:蛋白质复合物必须被拉下（图1）。蛋白质A、G和L是结合抗体恒定领域的细菌蛋白。虽然细菌用它来破坏免疫系统，研究人员已经加入这个系统，以方便抗体纯化，它用于预清除和下拉步骤。这些蛋白质对于不同的物种和不同的恒定域亚型有不同的结合亲和力-在选择知识产权条件时需要考虑的另一个因素。许多公司销售标有A/G标记的甘蔗珠（图1）、预制旋转柱或树脂来制造柱。通常，珠子和旋转柱用于较小的样品尺寸，而树脂用于散装纯化。

在本实验练习中，我们演示如何使用基于蛋白质 A/G Plus 的腺苷酸腺苷酸细胞从原生鼠胸腺细胞中纯化内源性蛋白 c-myc。该协议从细胞分解液制备开始，最后通过西方斑点分析验证成功的蛋白质提取。

Procedure

1. 使用蛋白质 A/G PLUS 加蔗珠进行免疫沉淀

细胞莱沙处理

在13，000rpm的微离心机中将10⁸胸腺细胞离心3分钟，并去除上清液。
注意:细胞数量将因所需蛋白质的表达水平和所选细胞类型而异。
用PMSF重新悬浮500μL裂化缓冲液RIPA中的细胞。
使用几个带涡旋的快速脉冲破坏细胞，然后用25G的针头在注射器上吸气几次。
注意:避免产生气泡。对于较大的细胞类型，请使用较大的针头（如 21G 针头）。
在冰上孵育细胞解乳10分钟。
在 13，000 rpm 转速下使莱沙在 4°C 下离心 15 分钟。
将上清液转移到新的，标记的微离心管。

预清除

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Results

上文详细介绍的过程结果如图 2 所示。从左到右，通道包含对照组（等型）、测试组（c-myc）、预清除裂化（裂化）和分子量阶梯（阶梯）。标记了 25 和 75 kDa 梯子带。#25 kDa 和 50 kDa 的两个突出带分别是结合抗体的轻链和重链，并且对 IP 或样品不特定。c-myc蛋白在西斑上运行约67kDa，通常在75 kDa梯带下方可见。在此印贝中，c-myc 波段在第二条通道中可见，但在第一通道中?...

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Application and Summary

简而言之，免疫沉淀是使用抗体分离特定蛋白质。在本例中，通过西方污点分析免疫沉淀的结果，以评估纯度。分离的蛋白质可用于随后的多种应用，包括:用于蛋白质结构的NMR、氨基酸序列的质谱法或用于酶表征的体外测定。IP 还可以描述蛋白质的相互作用伙伴的特征。例如，在分离后，DNA或RNA可以分离进行测序。共免疫沉淀评估蛋白质-蛋白质的相互作用。当目标蛋白在IP过程中被拉下时...

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References

Olliver, C. L. and Boyd, C. D. (1984). Immunoprecipitation of In Vitro Translation Products with Protein A Bound to Sepharose. In J. M. Walker (eds), Nucleic Acids. Methods in Molecular Biology (pp. 157-160). New Jersey: Humana Press.
Thurston, C. F. and Henley, L. F. (1988). Direct Immunoprecipitation of Protein. In J. M. Walker (eds), New Protein Techniques. Methods in Molecular Biology (pp. 149-158). New Jersey: Humana Press.
Anderson, N. G. (1998). Co-immunoprecipitation: Identification of Interacting Proteins. In R. A. Clegg (eds), Protein Targeting Protocols.Methods in Molecular Biology (pp. 35-45). New Jersey: Humana Press.
Jackson, D. I. and Dickson, C. (1999). Protein Techniques: Immunoprecipitation, In Vitro Kinase Assays, and Western Blotting. In P.T. Sharpe and I. Mason (eds), Molecular Embryology. Methods in Molecular Biology (pp. 699-708). New Jersey: Humana Press.
Trieu, E. P. and Targoff, I. N. (2015). Immunoprecipitation: Western Blot for Proteins of Low Abundance. In B. Kurien and R. Scofield (eds), Western Blotting. Methods in Molecular Biology (pp. 327-342). New York, NY: Humana Press.

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1. 使用蛋白质 A/G PLUS 加蔗珠进行免疫沉淀

细胞莱沙处理

在13，000rpm的微离心机中将10⁸胸腺细胞离心3分钟，并去除上清液。
注意:细胞数量将因所需蛋白质的表达水平和所选细胞类型而异。
用PMSF重新悬浮500μL裂化缓冲液RIPA中的细胞。
使用几个带涡旋的快速脉冲破坏细胞，然后用25G的针头在注射器上吸气几次。
注意:避免产生气泡。对于较大的细胞类型，请使用较大的针头（如 21G 针头）。
在冰上孵育细胞解乳10分钟。
在 13，000 rpm 转速下使莱沙在 4°C 下离心 15 分钟。
将上清液转移到新的，标记的微离心管。

预清除

向解毒剂中加入20μL蛋白A/G PLUS抗乳珠和1μg等型控制抗体（此处，使用小鼠IgG1等型控制抗体）。
注意:使用等型抗体的选择将取决于下拉步骤后面使用的蛋白质特异性抗体。
在冷室（4°C）的离心机旋转器上孵育解毒剂混合物30分钟。
在 3200 rpm 转速下将样品离心 30 s，在 4°C 下。
将预清除的上清液转移到新的，标记的1.5 mL微离心管。丢弃颗粒。

蛋白质浓度测定

通过执行布拉德福德测定测定，确定细胞莱沙的蛋白质浓度。
阿利胶1000μL布拉德福德试剂放入7个微离心管中。
将以下量的BSA蛋白标准（2mg/mL）加入6个管中（表1）。

管号	BSA 体积（μL）（2 毫克/升）	蛋白质浓度（μg/μL）
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

表 1:BSA蛋白质标准量

在第7管中，加入预清除的莱沙的1μL。
注意:为确保样品浓度在测定检测范围内，准备并分析1:2或1:5的莱沙稀释。
将 7 根管中的每根管中的 200 μL 放入平底 96 孔板的单个孔中，以三重层重复每个样品。
在 595 nm 的板读取板上读取板。
在 Excel 中生成标准曲线，并计算预清除的莱沙溶液的蛋白质浓度。

向下拉

将两个新鲜的 1.5 mL 微离心管标记为"控制"，另一个标记为"测试"，在此示例中为 c-myc。
将 500 μg 预清除的莱沙液放入每个管中。
注意:这里使用的蛋白质量取决于需要纯化的蛋白质的量。
使用莱沙缓冲液，将每根管的总体积调高至 500 μL。
在试组管中加入2μg抗c-霉素抗体，向对照组加入2μg小鼠IgG1等型对照抗体。
注:抗体的数量取决于抗体的疗效和目标蛋白的量。
在冷室（4°C）的旋转器上孵育管子2小时。
在每个管中加入20μL蛋白质A/G PLUS加加蔗珠。
注意:建议使用端切的移液器尖端，以防止损坏珠子。
在冷室（4°C）的旋转器上孵育过夜。
注意:根据靶蛋白和抗体的功效，此步骤从1小时到夜间不等。
在 3200 rpm 转速下将管在 30 s 4°C 下离心，以拉下珠子。
从每个管中吸出上清液。
注意:目标蛋白现在与珠子结合。
使用 500 μL 1X Dulbecco 的 PBS 清洗珠子两次。
在 3200 rpm 转速下将管在 30 s 4°C 下离心。
注意:对于更严格的洗涤，请使用更严格的缓冲液，如 RIPA。
从每个管中吸出缓冲液。使用凝胶加载技巧，从珠子中取出任何剩余缓冲液，并将珠子保存在冰上，以洗脱蛋白质。
注意:在此示例中，蛋白质通过沸腾珠子洗脱到SDS-PAGE运行缓冲液中，用于西方斑点分析。这种方法适用于验证 IP 结果或检查蛋白质-蛋白质相互作用。对于其他下游应用，如用于结构或酶分析的蛋白质的纯化，使用更复杂的系统，如表位标记（标记标记或霉菌标记）来避免与感兴趣的蛋白质的抗体洗脱。

2. 通过西布洛特分析进行知识产权验证

SDS-PAGE 电泳:

在含有β-梅卡托-乙醇的20μL SDS-PAGE加载染料中重新悬浮珠子。
将样品在95°C下煮5分钟。
在室温下，在 13，000 rpm 转速下将珠子离心 10 s。
使用凝胶加载技巧，仔细移液从珠子获得的样品，并将其加载到4-15%梯度SDS-PAGE凝胶的井中。
除了样品外，还装载带有蛋白质梯的车道以及带有预清除的莱沙的车道，以用作装载控制。
以 100 V 运行，直到染料正面到达凝胶底部（+1h）。

西布洛特分析:

制作西体三明治，确保PVDF膜在凝胶和红色阴极之间。
在 100 V 下传输 1 小时。
将膜置于室温下5 mL的阻滞缓冲液中，在低设置的摇臂上放置1小时，以阻止非特异性蛋白质结合位点。
注意:对于较大的血泡，可能需要增加阻塞缓冲液、原发抗体、二级抗体和洗液的体积。
在4°C的阻滞缓冲液中，用5 mL抗c-myc抗体在低设置下在摇臂上孵育。
注意:此处使用的抗体应不同于下拉步骤中使用的抗体。
使用 5 mL TBST 洗涤污点 3-6 次，在室温下，在低设置下，在摇臂上每次洗涤时间为 5 分钟。
用HRP标记的抗兔子光链二级抗体在阻隔缓冲液中孵育该斑点，在室温下在低设置下在摇臂上孵育1小时。
注意:二级抗体的选择将取决于用于西方斑点的原抗体。此外，在协议中使用了轻链特异性二次体，因为靶蛋白的分子量接近抗体的重链。如果目标蛋白接近50kDa，则使用光链特定的二次。如果目标蛋白接近25kDa，使用重链特异性二次。
使用 5 mL TBST 洗涤污点 3-6 次，在室温下，在低设置下，在摇臂上每次洗涤时间为 5 分钟。
从实验室湿巾上的斑点和 dab 边缘清除液体，以去除多余的液体。
用1x化学发光检测试剂盖住斑点，孵育1分钟。
注意:以下步骤应快速连续完成，因为检测试剂轻便且对时间敏感。
在实验室湿巾上涂抹斑点边缘，以去除多余的检测试剂。
将污点放在成像器托盘的成像表面上。
注意:化学发光的布有也可以用薄膜来可视化。
使用"化学发光程序"捕获从 10 秒到 5 分钟的多个时间点的图像。
注意:最佳时间可能会根据蛋白质数量和抗体质量而变化。
选择具有最佳波段可见性的图像，然后导出该图像。
在移动污点之前，使用成像器拍摄污点的照片，以捕获梯子的位置。然后，也导出该图像。
使用幻灯片准备软件（如 PowerPoint），对齐波段和梯形图像以形成单个图像。

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