这项工作得到了CIHR和加拿大NSERC资助。 VIT是一个新的CIHR调查和Concordia大学基因组学研究主席，细胞生物学和老化。

材料和方法酵母菌株和生长条件。 丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0）（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖） 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。 原油线粒体分数隔离<ol><li>长为48小时1升的野生型菌株BY4742文化</li><li>倒入500毫升NALGENE离心管文化。平衡离心负载和收获细胞在室温下在3000 XG 5分钟。 </li><li>倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟，离心沉淀细胞。 </li><li>倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟，离心沉淀细胞。 </li><li>确定细胞沉淀湿重。 </li><li>重悬浮颗粒细胞，在数码地面电视的缓冲缓冲/克（湿重）细胞[2毫升]。 </li><li>将细胞悬液50毫升猎鹰塑料管。 </li><li> 70在摇床转速在30 ° C 20分钟的旋转管</li><li>在3000 XG在室温下5分钟，离心收集细胞。 </li><li> Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞重悬于无Zymolyase毫升缓冲/克（湿重）细胞[7 ]。 </li><li>在3000 XG在室温下5分钟，离心沉淀细胞。 </li><li> Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞重悬于无Zymolyase毫升缓冲/克（湿重）细胞[7 ]。 </li><li>细胞悬液转移到一个玻璃瓶中。 </li><li>添加粉末Zymolyase - 100T [1毫克Zymolyase - 100T /克（湿重）的细胞，细胞悬液。 </li><li> 70在摇床转速旋转烧瓶与细胞悬液，在30 ° C 30分钟</li><li>传输原生质球形成由于Zymolyase - 100T至50毫升塑料离心管细胞壁的消化。 </li><li>佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C </li></ol> **所有后续步骤，应在4℃或冰面上进行。原生质球悬浮应轻轻削减提示使用移液器，以避免破坏细胞器处理** <ol start="18"><li>在同质化冰冷的缓冲缓冲/克（湿重）细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。 </li><li>佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C </li><li>在同质化冰冷的缓冲缓冲/克（湿重）细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。 </li><li>转移到玻璃匀浆冰预冷的细胞。 </li><li>使用一紧杵，均质15招杵细胞。 </li><li>加入1体积冰冷的同质化缓冲区。 </li><li>同质化原生质球转移至50毫升塑料离心管。 </li><li>颗粒完整细胞，细胞核，并在1500 XG 5分钟离心4大碎片° C。 </li><li>离心机3000 XG 5分钟产生的上清液在4 ° C。 </li><li> 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。 </li><li>倒出上清液，沉淀重悬在冰冷的同质化缓冲区[6.5毫升缓冲/克（湿重）细胞]。 </li><li> 3000 XG 5分钟离心4 ° C。 </li><li> 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。 </li><li>倒出上清液，重悬沉淀在冰冷的扫描电镜缓冲区3毫升。 </li></ol> **虽然这种悬挂在线粒体丰富，还含有其它细胞器，如内质网（微粒），高尔基体和空泡。为了得到纯净的线粒体，这种原油的线粒体分数可以受到进一步的分馏，如下所述** 线粒体的没有污染的其他细胞器的分离纯化<ol><li>广场1.5毫升冰冷的60％（W / V）蔗糖的EM缓冲区成贝克曼超清晰的离心管。 </li><li>覆盖60％（W / V）4毫升32％的蔗糖，1.5毫升23％，1.5毫升15％的蔗糖（所有WT / V在EM缓冲区）。 </li><li>将3毫升15％（W / V）蔗糖顶部原油在SEM中的缓冲区的线粒体的一小部分。 </li><li>在一个贝克曼SW41钛摆动斗1小时134000 XG（33000 RPM）在4 ° C转子离心机</li><li>完整的线粒体形式在60％/ 32％的蔗糖界面的棕色带。 </li><li>小心取出，直到达到线粒体乐队的蔗糖。 </li><li>删除一个切尖线粒体的乐队，用吸管和一个MLS - 5转子放入一个贝克曼离心管。 </li><li>用SEM缓冲区的填充管。 </li><li> MLS - 5 10000 XG（31000 RPM）为30分钟30分钟的转子离心沉淀的纯线粒体在4 ° C。 </li><li>倒出上清液采用吸管。 </li><li>使用纯线粒体线粒体功能，线粒体蛋白质组和lipidome和线粒体DNA的分析。 </li></ol>试剂<ol><li>数码地面电视的缓冲区[Tris/H2SO4（pH 9.4）的100毫米，10毫米二硫苏糖醇（15毫升） <ul style="list-style-type:none;"><li> 1.5毫升1个M Tris/H2SO4缓冲液（pH值9.4） </li><li> 150μL的1 M数码地面电视</li><li>卷15毫升</li></ul></li><li> Zymolyase缓冲液[20毫米磷酸钾（pH值7.4），1.2米山梨醇]（100毫升） <ul style="list-style-type:none;"><li> 2毫升1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4） </li><li> 60毫升的2米山梨醇</li><li>容至100 ml </li></ul></li><li>同质化缓冲液[10毫米的Tris /盐酸（pH值7.4），0.6米山梨糖醇，1 mM的EDTA，0.2％（W ​​/ V）牛血清白蛋白（250毫升] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2.5毫升的1 M Tris / HCl缓冲液（pH值7.4） </li><li> 75毫升的2米山梨醇</li><li> 500μL500 mM的EDTA </li><li> 0.5克的BSA </li><li>容积250毫升</li></ul></li><li>扫描电镜缓冲区[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾（pH值7.2），蔗糖250毫米，1毫米EDTA]（250毫升） <ul style="list-style-type:none;"><li> 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液（pH值7.2） </li><li> 31.25毫升2米蔗糖</li><li> 500μL500 mM的EDTA </li><li>容积250毫升</li></ul></li><li>电磁缓冲液[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾（pH值7.2），1 mM的EDTA]（250毫升） <ul style="list-style-type:none;"><li> 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液（pH值7.2） </li><li> 500μL500 mM的EDTA </li><li>容积250毫升</li></ul></li></ol>

<ol>
	<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry.">Biochemistry.</a> , (2004).</li><li>Suen, D. -. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics.">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li><li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+more+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li><li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+oxidants,+and+aging.">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

这种方法使高产的隔离从酵母细胞中的纯线粒体。通过这种方法纯化的线粒体其他细胞器的污染基本上是免费的，其净化后保留其结构和功能的完整性。所述的方法产生的线粒体适用于无细胞重组基本线粒体过程。这些高度纯净的线粒体也可以用于线粒体结构和功能，线粒体蛋白质组和lipidome，和线粒体DNA的分析。

purification of mitochondria from yeast cells

线粒体是ATP生产的主要场所，在真核细胞非光合细胞的有氧代谢<sup&gt; 1</sup&gt;。这些复杂的细胞器在细胞凋亡中发挥重要作用<sup&gt; 2</sup&gt;，细胞的生存<sup&gt; 3</sup&gt;，哺乳动物的发展<sup&gt; 4</sup&gt;，神经细胞的发育和功能<sup&gt; 4</sup&gt;，细胞内的信号<sup&gt; 5</sup&gt;和长寿调控<sup&gt; 6</sup&gt;。我们的线粒体控制这些复杂的生物过程的理解，依靠强大的方法，以评估它们的形态，其蛋白质和脂质成分，它们的DNA的完整性，他们的许多重要职能。芽殖酵母<em&gt;酿酒酵母</em&gt;，一种基因和生物化学来操作带注释的基因组和蛋白质组定义良好的，单细胞真核生物是一个有价值的模型研究线粒体的重要生物功能的分子和细胞的内在机制，。对于这些类型的研究，这是至关重要的高纯度线粒体。在这里，我们提出了一个迅速和有效的方法纯化的酵母线粒体的详细描述。这种方法使其他细胞器的污染基本上是免费的，保留其净化后的结构和功能完整性的高度纯净的线粒体的隔离。通过这种方法纯化线粒体是适合无细胞重组基本线粒体过程，可用于线粒体结构和功能，线粒体的蛋白质和lipidome，和线粒体DNA的分析。

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Purification of Mitochondria from Yeast Cells

我们描述了一个快速和有效的方法纯化的酵母线粒体<em&gt;酿酒酵母</em&gt;。这种方法使高产纯线粒体隔离，其他细胞器的污染基本上是免费的，并保留其净化后的结构和功能完整性。

从酵母细胞线粒体的纯化

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

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