我们衷心感谢Dinman实验室的所有成员，包括阿什顿Belew，莫文蔚杰克，Sharmishtha Musalga，谢尔盖Sulima，Shivani雷迪，他们的帮助和在这个项目上的投入和Michael Rhodin。这项工作得到了补助金，上午由美国心脏协会（AHA 0630163N）和开发部的国立卫生研究院（5R01 GM058859 - 12）。日航是支持美国再投资和恢复法案2009年补充父补助金（3R01GM058859 11S1）。

1。半胱氨酸负责筹备Sulfolink树脂<ol><li>准备Sulfolink树脂（皮尔斯）在室温下。 </li><li>广场共10毫升50％的Sulfolink耦合两个10毫升的塑料瓶制造商提供的凝胶浆，分发到每个小瓶5毫升。 </li><li>短暂离心瓶850 XG，小心取出上清液。 </li><li>耦合缓冲冲洗凝胶3次（50毫米三，pH值8.5，5毫米EDTA）resuspending在5毫升的珠子，离心850简要XG和消除吸取上清液。 </li><li>每管添加50毫米的L -半胱氨酸耦合缓冲溶液5毫升，混合浆料1小时25 ° C。 </li><li>删除残留洗涤步骤1.4以上所述的L -半胱氨酸。 </li><li> 10毫升结合缓冲液重悬凝胶[20毫米的HEPES，pH值7.6，5毫米镁（OAC）2，60毫米NH 4 CL，2毫米的数码地面电视]，和平衡的结合缓冲液10毫升冲洗树脂中所述的步骤1.4的3倍。倒出树脂到10 ml离心柱，帽和保存在4 ° C。为RNA结合树脂能力是〜20每毫升260个单位。 </li></ol> 2。使用半胱氨酸核糖体的色谱净化收取Sulfolink树脂注：如果与蛋白酶的活性，证明是一个问题的应变工作，可在随后的所有缓冲区使用蛋白酶抑制鸡尾酒。 <ol><li>保持冰的所有组件，并准备使用无RNase水和无菌过滤所有的解决方案。 </li><li>一夜之间日志中期阶段（外径595 ​​= 0.6 - 1.2），在适当的媒体成长的酵母细胞。离心沉淀细胞，并洗为5分钟1克细胞结合缓冲液，并在3700 XG离心机在4 ° C。 </li><li>悬浮细胞在结合缓冲液1毫升约2毫升的总量，并扰乱使用0.5毫米的玻璃珠等体积冷却到4 ° C U唱一个Biospec迷你珠打浆机（巴特尔斯维尔，确定）。样品可以根据需要分割成多个管。 </li><li>在离心30分钟，在一个贝克曼 - 库尔特舰最大发送超速离心机（富勒顿，加利福尼亚州）30,000 XG取出完整的细胞，细胞器和细胞碎片。 </li><li>使用前一分钟，颗粒树脂在1000 XG删除的存储解决方案。两个毫升树脂是用​​于一克的每一个细胞。 </li><li>删除从30,000 XG自旋（S30）的细胞裂解液上清，直接将收取的Sulfolink浆照顾，以尽量减少污染脂质的一小部分的顶部或在管底部的细胞碎片，并将其放置。脂质层，可避免通过去除或推从吸管尖后上清液越过。 </li><li>在冰上孵育S30/Sulfolink混合搅拌15分钟。 </li><li>放入15 m​​l锥形管列在1000 XG离心机v一个分钟。 </li><li>入列，用手拌匀，并孵化了15分钟在冰上将流出液组分。 </li><li>放入15 m​​l锥形管的列，并在1000 XG离心一分钟。舍弃流出液。 </li><li>第列和结合缓冲液中添加5毫升。手工混合列至重悬，取下镜头盖，并在一分钟1000 XG列离心机离心机。重复此洗涤协议两次。 </li><li>洗脱缓冲液1.5毫升（20毫米HEPES - KOH，pH值7.6，10毫米MG（OAC）2，氯化钾500毫米，2mm的数码地面电视，0.5毫克/毫升肝素），每一列。手工混合的泥浆，并在冰上孵育2分钟</li><li>进入新的15 ml锥形管和离心机的地点列在1000 1分钟XG。收集洗脱液。重复洗脱步骤，再次使最终合并后的样品量〜3毫升。的树脂可与洗脱缓冲液洗涤，无肝素和平衡约束力buffeR，并存储在10毫升卷的结合缓冲液在4 ° C，再以后使用。 </li></ol> 3。嘌呤霉素治疗注：另一种方法，以消除污染tRNA的物种是从富含葡萄糖葡萄糖耗尽的媒体，以促进核糖体径流开关。然而，这并不改变的酵母细胞，这可能会影响核糖体的功能和浓度的代谢状态。 为了地带核糖体从内源性肽酰- tRNA，与治疗嘌呤霉素进行。 <ol><li>中性pH值7.5 100毫米嘌呤的解决方案，在室温下加入1M氢氧化钾滴加。 </li><li>新增瓦解嘌呤解决〜1mm的终浓度洗脱液。 </li><li> 100毫米的GTP到终浓度为1毫米。 </li><li>孵育30分钟，30 ° C。 </li></ol> 4。通过甘油垫子沉淀净化核糖体<ol><li>放置一个毫升缓冲垫成4毫升量聚碳酸酯超速离心机管（20毫米的HEPES，pH值7.6，10毫米镁（OAC）2，500毫米氯化钾，2毫米数码地面电视，25％甘油）。 </li><li>轻轻层嘌呤霉素治疗垫顶部，洗脱组分离心样品在10万XG 4℃过夜° C。 </li><li>删除离心机转子管，吸出上清液。 </li><li>两次纯化的核糖体含有1毫升缓冲液洗颗粒。 </li><li>在100温柔中断使用玻璃棒的气垫缓冲液重悬核糖体。 </li><li>中断后，用封口膜管，并在一个适中的速度在寒冷的房间涡旋摇一小时。 </li><li>离心管，离心5分钟以最大的速度在4 ° C，传输的内容和新鲜管去除上清。 </li><li>重复步骤4.1至4.7 2毫升的缓冲垫，除了存储缓冲区100μL（50毫米的HEPES - KOH pH值7.6，50 mM的NH 4 CL，5毫米镁（OAC）2，1毫米DTT，25％的甘油）是用来代替气垫缓冲步骤4.4和4.5 。 </li><li>量化纯化的核糖体分光光度计（1一260 = 20 pmoles酵母核糖体），并储存于-80 ° C。从酵母1克的典型结果是300-400核糖体pmoles。 </li></ol> 5。代表性的成果： 从每个协议的三个主要步骤提取的RNA物种的一个例子是如图2所示。虽然rRNAs的主要品种目前在总细胞裂解物（T）的这些还含有大量的其他RNA物种。从Sulfolink列（SL）纯化的核糖体，也包含了这些物种的高柱床的亲和力以及由于大量的tRNA。从核糖体治疗，这在从肽酰- tRNA的多肽水解嘌呤结果的一小部分，并促进这些物种的解离。嘌呤霉素治疗的样本（下午）缺乏合作purifyin克tRNA的物种，从而代表完全纯净的核糖体。据此前报道8，这些核糖体是高度完整和生化活跃，使他们详细的功能和结构分析的理想衬底。 <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="图1"/> 图1。层析纯化方法的流程图。使用挂钩sulfolink树脂的半胱氨酸核糖体描绘。 <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="图2"/> 图2。代表分析核糖体的筹备工作。总RNA的物种分别提取总细胞裂解物（T）Sulfolink纯化的核糖体（SL），并随后与嘌呤霉素治疗Sulfolink纯化的核糖体，并通过甘油垫（下午）沉淀。巷M代表RNA的大小标记。乐队代表25S和18S rRNAs，以及tRNA基因和其他RNA物种表示。所有车道装有2微克的RNA。

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	<li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+microsomes;+an+integrated+morphological+and+biochemical+study.">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li><li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes.">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li><li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli.">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li><li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns.">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li><li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis.">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li><li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system.">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li><li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria.">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li><li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+purity,+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method.">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li><li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast:+evidence+for+three+sites.">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis:+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains.">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li><li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells.">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li><li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes.">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li><li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein.">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li><li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae.">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

核糖体净化协议主要涉及裂解细胞，收获一个细胞质分数从低转速旋转，然后造粒核糖体由高速离心1。虽然提出了一些新颖的方法已被用于净化细菌核糖体，同样没有被真正的真核生物2-4。虽然这些年来，例如盐清洗和甘油垫子（如看到5）增加额外的步骤，酵母核糖体的生化和结构的研究已阻碍了他们的倾向，成为在净化过程中的内源性降解酶降解，最有可能由于长期?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td></tr><tr><td> Sulfolink耦合树脂</td><td>刺穿</td><td> 20402 </td></tr><tr><td>迷你珠打浆机16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td>舰最大发送超速离心机</td><td> Beckman Coulter公司</td><td></td></tr><tr><td>联想RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0.5毫米的玻璃珠</td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td>三</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> E9884 </td></tr><tr><td>数码地面电视</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 CL </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> A9434 </td></tr><tr><td>氯化钾</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> 60128 </td></tr><tr><td>镁（OAC）2 </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> M5661 </td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> 221473 </td></tr><tr><td>甘油</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> G5516 </td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas公司</td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

真核生物核糖体相比，他们真细菌和archael更加不稳定，从而构成了重大挑战，研究人员。特别麻烦的是，细胞溶解释放大量的蛋白酶和核酸，这可以降低核糖体。因此，重要的是尽可能快地从这些酶中分离出来的核糖体。不幸的是，传统的差分离心方法叶时间不可接受的长期接触这些酶的核糖体，影响其结构的完整性和功能。为了解决这个问题，我们利用一个色谱法使用收费Sulfolink树脂半胱氨酸。这个简单，快速的应用显着降低水解蛋白和nucleolytic活动，共同净化生产完好，高度生化活性酵母核糖体的高产量。我们建议，这种方法也应适用于哺乳动物的核糖体。简约的方法，增强的纯度和色谱纯化的核糖体的活动的一个显著的技术进步，为真核细胞的核糖体的研究。

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Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

准备用传统的方法，纯化共同净化核酸酶和蛋白酶的真核细胞的核糖体的污染造成了消极影响下游的生化和结构分析。一个快速和简单的色谱的净化方法是用来解决这个问题作为一个模型系统中使用的酵母核糖体。

高活性酵母核糖体的色谱分离纯化

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

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16.6K 次观看.  University of Maryland. 准备用传统的方法，纯化共同净化核酸酶和蛋白酶的真核细胞的核糖体的污染造成了消极影响下游的生化和结构分析。一个快速和简单的色谱的净化方法是用来解决这个问题作为一个模型系统中使用的酵母核糖体。