我们承认卢尔德三角洲Arrueta安特克拉（昆虫学系，美国俄亥俄州立大学/ OARDC，伍斯特，俄亥俄州）提供的实验设置的帮助。我们感谢发送EAB幼虫样品贷瑞莎波兰博士（美国农业部森林服务，网络实名制）。帮助路易斯一个卡纳斯和Nuris中号阿科斯塔博士用显微镜设置赞赏。为这个项目提供了资金由国家拨俄亥俄州农业研究和发展中心，美国俄亥俄州立大学和联邦基金。

完整的协议与不同的步骤是描绘在图1的流程图。构成夹层的各个步骤，第一链cDNA合成，RNA提取和定量RT - PCR详述如下。 一，幼虫解剖<ol><li>在此过程的开始，地方白蜡窄吉丁，或EAB，幼虫在潮湿的纸巾，直到解剖执行。保持新鲜配制的1X的磷酸盐缓冲液在冰，或PBS，以保持整个解剖缓冲区冷。 </li><li>首先，修复的罚款清扫引脚的夹层板的EAB幼虫。然后，添加冷1X PBS夹层板。 </li><li>首先，杀头的清扫剪刀的罚款对幼虫。随后取出幼虫的最后腹节。 </li><li>钟表匠对使用产钳，电梯从幼虫尸体的角质层。然后，沿切口用一把剪刀的尸体的长度。采取切口，小心不要肠道破裂。 </li><li>小心地隔离其他组织如脂肪组织和结缔组织中肠组织。然后，在新鲜的1X PBS缓冲液冲洗组织，以确保没有fatbody污染。孤立肠转移到500μL预冷Trizol试剂1.5 mL Eppendorf管。 </li><li>接下来，隔离脂肪的身体组织，使用镊子，并转移到一个1.5毫升的Eppendorf管含500μL冷冻Trizol试剂。 </li><li>最后，从幼虫尸体隔离杀任何坚持组织照顾，不损伤组织的完整性，角质层组织。在新鲜的PBS缓冲液冲洗隔离角质层组织和500μL冷冻Trizol试剂转移到1.5 mL Eppendorf管。 </li><li>隔离的脂肪体，角质层和肠组织可以储存在-80 ° C直到RNA提取。 </li><li>在RNA的提取准备，各种EAB样本进行排序，根据发展阶段。这些阶段包括第一，第二，第三，第四，龄期，prepupae和成人。 </li></ol>二。 RNA的提取（每制造商为使用Trizol试剂协议） 同质化<ol><li>要开始RNA的提取，首先使用塑料杵均质Trizol试剂含有1.5 mL的Eppendorf管组织。同质化后，带来Trizol试剂每个样品TO1毫升的总量。 </li><li>对于处于发育阶段，同质化在液氮用迫击炮和杵整个动物。然后加入1毫升的Trizol匀浆等分（50微克）。 </li></ol>相分离行为： <ol start="3"><li>用1 mL Trizol试剂在室温下15分钟的孵育样品管。 </li><li>孵化后，每管200μL氯仿。立即加入氯仿后，大力摇管约15秒。然后，在室温下孵育管额外2-3分钟。 </li><li>接下来，离心15分钟的样品在2 ° C，12,000 XG离心后，将在水相中的RNA。水相的体积应该是600μL，或60％的总Trizol法体积。 </li></ol> RNA沉淀<ol start="6"><li>小心地取出只有水相。以下的水相物质的存在会导致提取的RNA污染。然后，水相转移到一个适当的标记的1.5 mL Eppendorf管。 </li><li>从水相中的RNA沉淀，混合每管0.5毫升的异丙醇。样品在室温下孵育10分钟。孵化后10分钟，离心管，在2 ° C 12000 XG </li></ol> RNA的洗<ol start="8"><li>离心后，弃管的上清液。 RNA是在试管底部形成的凝胶体状的颗粒。用75％乙醇洗涤沉淀，增加至少1毫升75％，每1毫升的Trizol乙醇。混合振荡。然后5分钟，离心管，在2 ° C 7500Xg </li></ol> RNA的洗脱<ol start="9"><li>丢弃上清液管。再次在1分钟的小桌子离心机离心管。从试管中取出，小心吹打任何多余的上清液。离开管打开，让沉淀空气干燥5-10分钟。要小心不要过分干燥的颗粒，因为这将大大降低其溶解度。 </li><li>空气干燥后，重新悬浮颗粒<a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">酸二乙酯</a> ，或DEPC处理，处理后的水。水用于悬浮颗粒的数量将取决于颗粒的大小。使用50μLDEPC处理水为SM全部为大颗粒的沉淀或100μL。让沉淀完全DEPC处理水溶解移动枪头向上和向下几次。 </li><li>一旦沉淀溶解，放置在55 ° C，10分钟的样品。 </li><li>然后，测量每个RNA样品的浓度，使用Nanodrop分光光度计（2μLRNA样品）。 </li><li>的RNA样品存放在-80 ° C，直到进一步的使用。 </li></ol>三。第一链cDNA合成（由于每个制造商使用标第一链合成试剂盒由Invitrogen S协议。） <ol><li>对于每个RNA样品在PCR管中添加以下内容： <table border="0"><tbody><tr><td>核糖核酸</td><td> xμL </td></tr><tr><td> 10MM的dNTP组合中号</td><td>加入1μl </td></tr><tr><td>以oligo（dT）（0.5μg/μL的） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DEPC处理水</td><td> （8 - X）μL </td></tr><tr><td> 总成交量： </td><td> 10μL </td></tr><tr><td colspan="2">注：X是用于cDNA合成的RNA的量。 2-3微克的RNA取决于RNA的浓度，将用于每一个反应，每个反应总体积应该是10μL。 </td></tr></tbody></table></li><li>将上述反应混合在热循环在65 ° C，4分钟。 </li><li>从theromocyler取出的管子和至少2分钟，立即放在冰上。 </li><li>第一链预混准备加入以下： <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RT缓冲</td><td> 2μL </td></tr><tr><td> 25MM氯化镁2 </td><td> 4μL </td></tr><tr><td> 0.1M的数码地面电视</td><td> 2μL </td></tr><tr><td>核糖核酸酶进行</td><td> 1μL </td></tr></tbody></table></li><li> 9预混液添加到每个试管中的RNA样品，由pipeting混合和离心机的混合物简要。 </li><li>管放置在热循环和42 ° C孵育2分钟</li><li>暂停的热循环，并添加1μL标II逆转录酶（Invitrogen公司），以每管。这一步应该是迅速完成。 </li><li>样品在42℃孵育1.5小时。 </li><li>终止反应，在70℃15分钟。 </li><li>删除从热循环管，并置于冰上。 </li><li>每个试管中加入1μl的RNase H的，将它们放置在热循环在37℃20分钟彗星。 </li><li>热循环仪的样本后，在每管加入20μL无核酸酶水。每个样品量的一倍，在这个阶段。 </li><li>检查使用2μL的样品，每个样品的浓度。每个样品等分，使用QRT - PCR20ng/μl的浓度。适量的水，以弥补样品浓度的20ng/μl将取决于初始浓度的合成cDNA。 </li></ol>四。 QRT - PCR： 参照基因的引物设计和测定<ol><li>与熔融温度为60℃，产品尺寸〜100bp（TM）设计引物。 </li><li> AP - PERI1是用来作为本实验的基因利益。一个参考基因或内部控制是需要的数据以供日后分析和正常化。核糖体蛋白（AP - RP1）作为本实验的参考基因。 </li><li>准备将用于引物，包括参照基因5um的股票。 </li></ol>制备标准<ol start="4"><li>为了计算标准应被用来引物的效率。 </li><li>制作的cDNA混合从不同的样本，将测试。 </li><li>图中的每个点5倍的系列稀释。四稀释应该足够，但五是高度推荐。 </li><li>多少分多少技术复制正在使用量会有所不同而有所不同。应该有足够使包括参照基因测试每一个基因的标准。 </li></ol>板模板<ol start="8"><li>设计模板QRT - PCR板，每孔样品名称。请记住，包括每个基因的标准，至少有两个技术是每个样本重复。 </li></ol>设立循环参数<ol start="9"><li> QRT - PCR的机器上打开和进入循环参数。这个实验的循环参数如下： 第1步： <ul><li> 1个循环：95℃3分钟</li></ul> 第2步： <ul><li> 40个循环：95 ° C 15秒60℃30秒，其次是 （可选：包括以下步骤确定熔解曲线） </li></uL&gt; 第3步： <ul><li> 1个循环：95℃1分钟</li></ul> 第4步： <ul><li> 1个周期：55℃1分钟</li></ul> 第5步： <ul><li> 81个循环：55℃30秒</li></ul></li></ol> CFX96（BioRad公司）机板成立<ol start="11"><li>准备掌握组合中的每个单独的管（包括参照基因）的基因。每口井，由主混音<table border="0"><tbody><tr><td>核酸免费水</td><td> 2μL </td></tr><tr><td> 2.5 × SYBR GREEN </td><td> 4μL </td></tr><tr><td>底漆向前</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>底漆反向</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> 总成交量 </td><td> 8μL </td></tr></tbody></table></li><li>虽然准备的主结构包括1-2帐户额外的移液错误反应。 </li><li>根据先前设计的模板，添加2μL（20毫微克/μL）的cDNA，每孔。然后，添加8μL的主结构，每孔，导致总量的10％μL反应。 </li><li>移液器向上和向下（2 - 3X），以确保样品充分混合。检查没有液体停留在刀尖。为了避免交叉污染，每个样品使用一个新的提示。 </li><li>一旦整个板块的设置，覆盖板，光学磁带。避免触摸磁带作为油脂的存在可以影响阅读。然后，离心1分钟的转速在500板，以确保所有产品在井是在盘底。 </li><li>离心后，检查有没有冰或水盘底。最后，放置在QRT - PCR机板和运行PCR程序。 </li></ol>五实验图解<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="图1" /> 图1：流程图描绘的基因表达研究中的步骤的顺序。 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="图2" /> 图2：一）幼虫的EAB在中间夹层显示肠。二）孤立肠幼虫的EAB <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="图3" /> 图3：a）平均为peritrophin基因在不同的幼虫组织，包括角质层（铜），肠（MG）和脂肪体（FB），（AP - PERI1）的相对表达值（ REVS）。 EAB特定的核糖体蛋白（以下简称命名，AP - RP1）的正常化感兴趣的基因，AP - PERI1获得的数据作为内部控制。 b）相对倍数变化AP - PERI1幼虫组织。角质层组织表明，至少表达，因此，校准器（1X）样本（Pfaffl 2001年）。 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="图4" /> 图4：a）平均为peritrophin基因在不同发育阶段的EAB包括幼虫（第一，第二，第三和第四），prepupae（PP）和成年人（一）（AP - PERI1）的相对表达值（REVS） 。 EAB特定的核糖体蛋白（AP - RP1）的正常化感兴趣的基因，AP - PERI1获得的数据作为内部控制。 b）相对在不同发育阶段的变化对AP - PERI1倍。 PP抽样调查表明mRNA水平的水平，因此，校准器（1X样品）。 六。结论实时定量PCR（QRT - PCR）是一种有效的工具来诊断，在不同的昆虫组织和发育阶段的mRNA水平。此外，QRT - PCR大多是从高通量基因表达分析，如芯片和新一代的RNA - Seq的产生的数据的主要工具，以验证。

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	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

获得每个样品定量RT - PCR板的阈值循环（CT）的价值。为了使标准曲线，Ct值，每个稀释度获得暗算其浓度的日志。实验样品的CT值，然后到这个系列稀释标准曲线的绘制。目标数量分别计算每一个实验，即组织和发育中的表达产生不同的标准曲线。相对表达值（REVS），然后确定内部控制获得的数量（AP - RP1）除以利益的目标序列的数量（在这种情况下，AP - PERI1 ）。计算的意义，每个...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

白蜡窄吉丁（EAB，<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;）是一种外来入侵害虫，已造成以百万计的白蜡树（<em&gt;白腊</em&gt; SPP）在北美。<strong&gt;</strong&gt; EAB继续迅速传播和攻击灰不同年龄的树木，从成熟的树木树苗。然而，迄今为止很少或没有分子知识的EAB存在。我们感兴趣的是破译的分子为基础的生理过程，在组织水​​平，援助的EAB成功定植白蜡树。在这份报告中，我们有效地利用实时定量PCR（QRT - PCR），以确定在不同的幼虫组织（包括肠，脂肪体和角质层）和不同发育阶段（包括1的表达水平<sup&gt; ST</sup- 2<sup&gt; ND</sup&gt; - ，3<sup&gt; RD</sup- 4<sup&gt; TH</sup&gt;龄，prepupae和成人）的EAB。作为一个例子，一个peritrophin基因（本文命名，<em&gt; AP - PERI1</em&gt;）例证感兴趣的基因和核糖体蛋白（<em&gt; AP - RP1</em&gt;）作为内部控制。 Peritrophins围食膜/矩阵（PM），这是昆虫肠道内壁的重要组成部分。下午有多种功能，包括消化和机械保护中肠上皮细胞。

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

实时定量PCR（QRT - PCR）是一种有效的工具来诊断，在不同的昆虫组织和发育阶段的mRNA水平。在这份报告中，我们使用QRT - PCR在不同的幼虫组织确定的mRNA水平和侵入性的昆虫物种，白蜡窄吉丁的发展阶段。

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Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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