首先将 500 μL 裂解缓冲液添加到先前获得的 A2780 细胞沉淀中,并使用最小开口直径为 2 毫米的切头轻轻混合。每毫升加入20微克新鲜制备的RNase,并通过温和的倒置混合。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。
在孵育结束时,加入蛋白酶K至每毫升100微克的终浓度,轻轻倒置10次。在 55 摄氏度下再次孵育一小时,每 10 分钟倒置试管。将500微升苯酚:氯仿:异戊醇试剂移入试管中,轻轻倒置试管约20次。
在室温下以9, 391 G离心15分钟。将上层水性粘性层移液到新管中。加入等体积的氯仿,轻轻倒置混合。
离心管一次后,收集水层。管中加入适量5摩尔氯化钠,使浓度增加0.2摩尔。将两体积的100%乙醇加入试管中,轻轻倒置20次。
在室温下以15, 871 G离心五分钟。弃去上清液后,加入500微升70%乙醇。在相同条件下再次离心,然后弃去上清液。
将沉淀风干后,加入50微升无菌无核酸酶的水,使其再水化。然后通过使用切割尖端移液来混合DNA。使用紫外分光光度法测量DNA的浓度。
消化DNA后,使用0.8%琼脂糖将其分离。将琼脂糖凝胶浸入室温下将琼脂糖凝胶浸入0.25摩尔盐酸溶液中10分钟,轻轻搅拌。然后用蒸馏水冲洗凝胶两次。
为了使DNA变性,将凝胶浸入氢氧化钠和氯化钠的溶液中。然后用蒸馏水冲洗凝胶两次。为了中和所示的DNA,将凝胶浸没在pH 7的0.5摩尔盐酸和3摩尔氯化钠的溶液中。
提取子基因组DNA表现出良好的完整性,表明其可用于端粒限制性内切片段的进一步下游加工。