Multiplex Immunofluorescence Staining and Image Analysis

在多重免疫荧光染色之前，固定组织并进行脱蜡和内源性过氧化物酶抑制。然后对于多重免疫荧光染色，将载玻片浸没在含有10毫摩尔柠檬酸盐缓冲液的300毫升染色罐中，并补充0.1%Triton X-100。将盖子盖子放在微波炉中以最大功率放置染色罐三到五分钟，直到缓冲液开始沸腾。

煮沸后，将微波炉置于低功率下 15 分钟，将缓冲液置于接近沸腾的温度。同样，通过将微波炉置于最大功率 90 秒来加热缓冲液。从微波炉中取出罐子，让缓冲液在室温下冷却 15 分钟。

在蒸馏水中冲洗载玻片三次，每次五分钟，然后在含有 0.1% 吐温 20 或 TBS 吐温的 Tris 缓冲盐水中冲洗五分钟。最后一次洗涤后，通过在纸巾上吸干载玻片来去除TBS补间。接下来，将载玻片放在显微镜载玻片盒上，并用疏水笔包围组织。

通过用溶解在TBS吐温中的5%BSA覆盖组织来阻断非特异性结合位点。30分钟后，通过在纸巾上吸干载玻片来去除封闭缓冲液。接下来，将组织与 300 微升在 1%BSA（TBS 吐温）中稀释的一抗孵育 60 分钟。

孵育后，用TBS吐温冲洗载玻片三次，每次三分钟。洗涤后，用300微升Poly-HRP二抗孵育组织40分钟。孵育后，用TBS吐温冲洗载玻片三次，每次三分钟。

接下来，将组织与300微升荧光染料酪胺试剂在硼酸盐缓冲液中稀释200倍，即席补充0.003%过氧化氢一起孵育组织10分钟。然后用TBS吐温冲洗载玻片三次，并将组织在4摄氏度下用稀释在1%BSA，TBS吐温中的人泛细胞角蛋白抗体孵育过夜。第二天，用TBS吐温冲洗组织，并与直接偶联的二抗与荧光染料偶联120分钟，在1%BSA，TBS吐温中稀释200倍。

孵育后，用TBS吐温冲洗组织，然后用双苯甲酰亚胺在10%BSA中稀释1， 000倍，TBS吐温染色细胞核5分钟。在蒸馏水中冲洗组织三次，每次三分钟，然后使用荧光安装介质和硼硅酸盐盖玻片将其安装在载玻片上。对于图像分析，请将扫描导入图像分析软件。

然后转到“分析”选项卡，并通过单击“设置”、“操作”和“加载”来选择高重荧光算法。选择“染料选择”选项卡和感兴趣的染料。在“核检测”选项卡中，转到“核分割类型”，然后选择“AI 自定义”。

然后在“核分割分类器”中，选择保存的训练 AI.In“膜和细胞质检测”选项卡，选择最大细胞质半径和膜染料数量。对于每种染料，选择细胞核阳性阈值、细胞质阳性阈值和膜阳性阈值。对于每种染料，选择细胞核、膜和细胞质的完整性百分比值。

通过选择“设置”、“操作”和“保存”来保存算法。通过单击分析并选择注记图层来分析感兴趣区域。然后转到“结果”选项卡并选择“对象数据”中的所有数据。

通过右键单击导出并选择对象数据.csv，以 CSV 格式导出数据。显示了通过多重免疫荧光进行最佳染色的代表性结果。选择正确的稀释度对于验证抗体特异性和优化染色的信噪比至关重要。