Mouse Retina Isolation and Flattening

固定安乐死小鼠的去核眼球后，将其转移到载玻片上并将其置于解剖显微镜下。使用镊子夹住角膜边缘以防止眼球运动。用解剖剪刀，通过角膜巩膜巩膜边缘在角膜周围切开约一毫米的深度，然后取下晶状体和玻璃体。

将视盘保持在中心，沿四个象限径向切割视网膜，达到视网膜半径的大约 2/3。用齿镊钳夹住巩膜边缘之一。用无齿镊子握住巩膜边缘，然后从带齿的镊子向巩膜底部移动。

小心地剥离视网膜。使用移液管用200微升PBS润湿视网膜。使用吸水纸去除多余的PBS，并在需要时用小毛刷压平视网膜。

慢慢地将冷甲醇逐滴添加到视网膜的内表面上，直到它完全覆盖。一旦视网膜变白并发展出更大的韧性，用小刷毛刷轻轻地平整视网膜并去除杂质，例如残留的色素膜和玻璃体。倒置视网膜后，如前所述用甲醇处理，并将其转移到24孔板的孔中，将其浸泡在甲醇中，并在20摄氏度下储存一至两个小时，以便立即免疫染色。

然后从板中去除甲醇后用PBS冲洗视网膜。采用共聚焦显微镜观察甲醇处理前后视网膜视黄醇神经节细胞，表明甲醇保存12个月不影响RGC免疫染色。