Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells

首先，将细胞保持在75平方厘米的培养瓶中。吸出培养基并用不含钙和镁的PBS冲洗细胞。接下来，加入两毫升0.25%胰蛋白酶EDTA以分离粘附细胞。

在室温下孵育五分钟，然后将细胞重悬于10毫升培养基中。接下来，将烧瓶中的细胞收集到15毫升离心管中。在室温下以480 G离心5分钟并吸出培养基。

根据培养物的原始汇合度，将细胞重悬于5至10毫升培养基中。取出 100 微升细胞，加入装有 100 微升 0.4% 台盼蓝的 1.5 毫升管中。将细胞添加到血细胞计数器中，并通过在显微镜下观察并使用手动计数计数器对其进行计数。

将细胞稀释至三倍，在无酚红的培养基中每毫升10至第四个细胞。根据制造商的说明，将2.5毫升细胞悬液添加到带有聚-D-赖氨酸包被盖玻片的六孔板的每个孔中。在加湿的培养箱中以37摄氏度和5%二氧化碳培养细胞过夜，以使细胞附着在盖玻片上。

第二天，使用20X物镜在倒置显微镜下检查细胞附着。制备所需浓度的处理储备溶液，并创建仅培养基对照、浓度与测试化合物匹配的纯载体对照以及具有离子载体FCCP和测试化合物的对照。一次使用一张盖玻片，向细胞中加入1.8毫升用于研究条件下的培养基。

将用对照或测试化合物处理的细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下在潮湿的环境中孵育所需的时间。在治疗期后，向细胞中加入200微升10X TMRE。在 37% 二氧化碳加湿的环境中在 37 摄氏度下孵育 15 至 30 分钟。

轻轻吸出培养基并用PBS冲洗细胞两次，以尽量减少背景干扰。然后将盖玻片倒置到标有治疗条件的显微镜载玻片上。对细胞在549纳米激发和575纳米发射下存活的图像。

利用共聚焦显微镜在细胞完整性丧失之前以高速图像捕获捕获多个Z堆栈场。保存并存储图像文件以供以后分析。具有活性线粒体的细胞保留了TMRE染色并显示出高荧光。

去极化或无活性线粒体的膜电位降低，无法保留TMRE，并显示低荧光信号。