离心FACS分离的卫星细胞并弃去上清液。用一毫升PBS洗涤细胞,离心,并在冰上的一毫升冷核提取缓冲液中孵育20分钟。将 20 微升刀豆球蛋白 A 包被的磁珠加入含有 850 微升冷结合缓冲液的 1.5 毫升管中。
然后使用磁性架,用一毫升冷结合缓冲液洗涤珠子两次,让珠子在管架上的管侧积聚五分钟,然后轻轻地将它们重悬于 300 微升冷结合缓冲液中。接下来,离心细胞核并将它们轻轻重悬于 600 微升核提取缓冲液中。然后将 600 微升提取的细胞核与 300 微升刀豆球蛋白 A 珠浆混合,并在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。
使用磁架除去上清液后,用一毫升冷封闭缓冲液重悬珠结合的细胞核。再次,除去上清液,用一毫升冷洗缓冲液洗涤珠结合的细胞核两次。分离上清液,用特异性一抗轻轻重悬核珠复合物,并在 4 摄氏度下温育过夜,轻轻搅拌。
第二天,除去上清液并洗涤珠子结合的细胞核,然后重悬于100μL冷洗缓冲液中。将 100 微升稀释的蛋白质 A-微球菌核酸酶加入 100 微升珠子结合核中,并在 4 摄氏度下搅拌孵育 1 小时。孵育后,除去上清液并洗涤珠子结合的细胞核两次,然后将它们重悬于150μL冷洗缓冲液中。
接下来,加入 3 微升 100 毫摩尔氯化钙,轻弹快速混合,并在冰上孵育 30 分钟。加入 150 微升终止缓冲液终止反应,并在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。离心样品并将上清液转移到新的微量离心管中,丢弃沉淀和珠子。
然后加入3微升10%十二烷基硫酸钠和2.5微升每毫升20毫克蛋白酶K.倒置混合,在70摄氏度下孵育10分钟。然后加入 300 微升苯酚:氯仿:异戊醇并涡旋,然后转移到两个毫升锁相管中。离心并向同一管中加入300微升氯仿。
再次离心并将上清液收集到1.5毫升管中。接下来,加入 1 微升糖原,然后加入 750 微升 100% 乙醇,让 DNA 在零下 20 摄氏度下沉淀过夜。第二天,通过离心沉淀DNA,然后用一毫升100%乙醇洗涤沉淀并离心两次,然后用移液管除去残留的乙醇。
将沉淀风干五分钟,并将其重悬于25微升tris-EDTA缓冲液中。H3KME2 和 H3K27AC 围绕 PAC7、ITGA7、LAM2、CXCR4 和 VCAM1 的 TSS 富集。然而,H3K4ME2和H3K27AC在ITGAM、PTPRC、PECAM、CKM或MHY3中没有得到富集。
IgG样品几乎没有获得任何信号。图中显示了 HOMER 已知基序分析、AR 峰和卫星细胞以及目标区域的百分比。Seeker 分析揭示了近 500 个峰值得分高于 50 的峰值,其中 200 多个峰值得分高于 100。