Isolation of Stromal Vascular Fraction (SVF) from Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

在二级层流罩下工作时，首先依次清洗从小鼠收集的血管周围脂肪组织或PVAT两次。首先，使用含有 10% 青霉素-链霉素的 PBS，然后使用补充有 1% 青霉素-链霉素的 PBS。将冲洗过的组织转移到无菌的60毫米培养皿中，并向其中加入200微升消化液。

使用无菌剪刀，将组织切成尺寸为一立方毫米的碎片。在无菌剪刀的帮助下，剪开塑料移液器尖端以加宽其末端。然后使用宽端移液器吸头将切碎的组织混合物转移到 15 毫升离心管中。

向组织中加入六毫升消化液以启动消化。将试管水平绑在架子上后，在轨道振荡器中以 37 摄氏度孵育 30 至 45 分钟。每 5 到 10 分钟，从培养箱中的摇床中取出试管，然后手动上下剧烈摇晃。

将消化的组织混合物通过 70 微米细胞过滤器进入 50 毫升离心管。用等体积的培养基冲洗过滤器，以最大限度地提高细胞产量和淬灭消化。将滤液转移到新的 15 毫升离心管中。

离心管以分离基质血管部分或SVF。倒置试管以弃去上清液，并将沉淀重新悬浮在5毫升PBS中。再次以1,800G离心管5分钟，然后弃去上清液。

将沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中。将细胞接种到胶原蛋白包被的 12 孔板中，并在 37 摄氏度的潮湿气氛中用 5% 二氧化碳孵育过夜。第二天，通过吸出培养基并用预热至37摄氏度的补充抗生素的PBS洗涤细胞来去除细胞碎片和红细胞。

最后，向每个孔中加入一毫升新鲜培养基，并继续培养细胞，直到它们达到所需的汇合阶段。