首先，取准备好的酵母亚线粒体囊泡，并将生成的囊泡和剩余的完整线粒体在 20， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 20 分钟。完整的线粒体形成沉淀，而囊泡留在上清液中。接下来，将上清液转移到新鲜的超速离心管中。
使用装有套管的一毫升注射器在管底部加载0.3毫升2.5摩尔蔗糖溶液的垫子，并在4摄氏度下以118,000G离心100分钟。离心后，囊泡将在蔗糖垫的顶部显示为圆盘。弃去约90%的上清液。
为了收获浓缩的囊泡，将它们重悬于剩余的缓冲液中，包括通过移液的2.5摩尔蔗糖。将悬浮液转移到冰冷的Dounce均质器中，并使用聚四氟乙烯陶器将悬浮液匀浆至少10次。接下来，准备一个 11 毫升的步进梯度，每层含有 2.2 毫升蔗糖溶液。
使用此公式计算蔗糖浓度。将最高浓度的蔗糖加入离心管中，置于零下20摄氏度，直至层完全冻结。使用折光仪测量样品的蔗糖浓度。
如果没有折光仪，假设蔗糖浓度为 2 摩尔。要将蔗糖浓度调节至 0.6 摩尔，请在 pH 7.4 下加入适当的 MOPS、E-D-T-A、P-M-S-F 和蛋白酶抑制剂混合物。小心地将样品加载到蔗糖梯度上，以避免梯度的干扰。
将囊泡在200,000G和4摄氏度下离心12小时。如果可能，请设置缓慢的加速和减速以避免梯度中断。然后使用一毫升移液管从上到下以 700 微升馏分收获梯度。
得到 17 个馏分，这提供了足够的分辨率。接下来，通过向各个馏分中加入 200 微升 72% 三氯乙酸并混合直至溶液均匀，进行两次顺序执行的三氯乙酸沉淀。将馏分在冰上孵育 30 分钟，并通过在 20， 000 G 和 4 摄氏度下离心 20 分钟来沉淀沉淀的蛋白质。
弃去上清液。加入500微升28%三氯乙酸溶液。充分混合并重复离心步骤。
最后，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析馏分。本文将介绍轻度超声处理的重要性。线粒体外膜标记物 Tom40 在早期的低密度组分中富集，在后期组分中几乎不存在。
线粒体内膜标记物 Tim17 集中在高密度组分中。相反，接触位点蛋白Mic60累积了中间蔗糖浓度的侵犯，表明各种膜囊泡的成功生成和随后的分离。相比之下，在更苛刻的超声处理条件下，线粒体外膜标记物 Tom40 可以在梯度的较低部分检测到。
此外，还有大量 Tim17 违反中间密度。
