首先，将组装好的 micro sim 设备放入无菌软管夹中amps。在大型无菌培养皿中培养装置。为了增加湿度，放置一个装满无菌水的 50 毫升锥形管盖。
要准备用于细胞培养的设备，请用 100 微升水冲洗顶部腔室。接下来，通过混合胶原蛋白四、牛纤连蛋白和无菌水来制备包衣溶液。从顶部腔室中除去水，加入 100 微升涂层溶液。
在 37 摄氏度下孵育腔室 2 到 4 小时。孵育后，用100微升室温HECSR替换顶部腔室中的涂层溶液。在底部腔室中加入 20 微升 HECSR 溶液。
为了传代EECM-BMEC样细胞，向细胞中加入细胞分离酶混合物，并在37摄氏度下孵育5至8分钟。接下来，移液细胞悬液并将其加入离心管中内皮培养基体积的四倍。以 200G 离心 5 分钟，然后将细胞重悬于 1 毫升 HECSR 中。
在顶部腔室中以每平方厘米40， 000个细胞的密度接种细胞，并在37摄氏度下孵育2至4小时，以促进细胞粘附。孵育后，在两个腔室中用新鲜的HECSR交换培养基。通过将 20 微升 100% 甲醇（在零下 20 摄氏度下冷却）加入底部腔室和 50 微升（在顶部腔室中）来固定细胞。
将设备在室温下孵育 2 到 10 分钟。接下来，通过在底部腔室中加入 20 微升 PBS 和在顶部腔室中加入 100 微升来洗涤细胞。每次洗涤后，确认底部腔室中没有气泡。
通过将 20 微升封闭溶液加入底部腔室和将 50 微升加入顶部腔室来封闭细胞 30 分钟。封闭后，用 50 微升一抗溶液替换顶部腔室中的体积，并在室温下孵育 1 小时。PBS 洗涤后，将 50 微升二抗溶液加入顶部腔室中，避光孵育 1 小时。
PBS 洗涤后，将 50 微升 Hoechst 加入顶部腔室并孵育 3 分钟。然后向底部腔室中加入 20 微升 PBS，向顶部腔室加入 100 微升。立即在共聚焦显微镜上对设备进行成像。
使用湿式长工作距离40倍物镜定位膜窗口，并切换到荧光通道以检查Hoechst和液络部染色。本文展示了 HIPSC 细胞培养和种子下 BPLC 的最佳坐位密度。与原代共培养相比，HIPSC 衍生的共培养物在相差成像中更容易区分。
低BPLC播种导致寄生虫覆盖率差和结块，而暴饮暴食会导致寄生虫层从膜上剥落。在免疫染色的HIPSC衍生细胞共培养物中，可以看到两层细胞非常接近，仅由薄的氮化硅纳米膜隔开。在通透性测定中，培养两天的内皮细胞通透性的高变异性表明两天的培养不足以实现屏障成熟。
此外，从4天开始，屏障成熟后，实验室之间的渗透性没有显著差异。
