首先,将胎盘样本的切除片放入PBS中。丢弃绒毛膜板、母体蜕膜和标本上任何可见的梗死。将剩余的组织标本解剖成横截面直径约为0.5厘米的绒毛状外植体。
将外植体转移到装有新鲜PBS的培养皿中。用一把镊子,摇动PBS中的每个外植体以去除所有血液。在无菌罩下,使用鲁尔锁将五个腔室连接到储液瓶。
将腔室倒置并取下底部。现在使用镊子将金属板放在腔室顶部的中央,销钉朝上。用一毫升预热培养基填充一半的腔室。
将另外 20 毫升培养基加入储液罐中。用镊子小心地将绒毛外植体放在腔室中金属板的针头上。将四个外植体放入一个腔室中。
重新连接腔室的底部以将其关闭。接下来,将泵管连接到泵上,将流路与生物反应器内的蠕动泵连接起来。在第四阶段修复它。
在“泵”菜单下,选择“手动”模式。将泵速调整为每分钟一毫升,然后单击“运行”开始泵送。在填充过程中将腔室保持在一定角度,以确保完全填充。
填充过程完成后,再次倒置腔室。确认腔室牢固并关闭生物反应器的两个盖子。组织孵育完成后,单击“中止”以停止泵。
一次打开两个生物反应器盖和一个流动室。使用镊子小心地从金属板上取出外植体以进行进一步分析。免疫组织化学染色的外植体在新鲜和流动培养组织中显示出细胞骨架结构良好且有组织的视觉呈现。
随着时间的流逝,在静态外植体中越来越多地观察到微丝聚集,这意味着细胞骨架结构的退化。苏木精和伊红声明证实了组织完整性随培养时间的减少。新鲜组织显示致密且紧密堆积的基质。
流式培养48小时后,观察到合胞滋养层的部分分离片段。在静态培养条件下,24 小时后组织完整性已经未充分保存,48 小时后进一步恶化。内皮细胞染色显示新鲜组织中具有独特组织的细胞。
即使在流动培养物中 48 小时后,形态学完整性仍得到广泛保持。然而,即使在 24 小时后,静态外植体也表现出部分塌陷,48 小时后进一步恶化。