Dual-Reporter IgG and IgM Serological Assay for Simultaneous Antibody Detection of Borrelia

通过在 96 孔板中将 5 μL 血清样品与 120 μL 测定缓冲液混合来开始人血清样品稀释。通过将 10 微升初始稀释液与 70 微升测定缓冲液混合，再稀释至 8 倍。现在，制备 100 微升含有靶抗原偶联微珠的微珠混合物。

接下来，在Falcon管中将制备的微珠混合物稀释在2.4毫升测定缓冲液中。通过将 25 微升珠悬浮液移液到指定的孔中开始血清孵育。将 25 微升 200 倍稀释的血清加入带有珠悬浮液的孔中。

用微孔板密封盖住96孔反应板。然后将带有珠子的板在板振荡器上孵育。孵育后，从板振荡器中取出 96 孔反应板。

将板放入磁性垫板器中，取下粘性板密封。接下来，用 100 微升洗涤缓冲液洗涤珠子三次，然后在最后一个洗涤步骤后从珠子中吸出最终洗涤体积。对于第一次抗体孵育，首先在测定缓冲液中制备新鲜的 IgG 和 IgM 双检测试剂混合物。

将30微升检测试剂移液到每个指定的孔中，然后用微孔板密封盖住96孔的反应板。将板在板振荡器上以 20 摄氏度以每分钟 750 转的速度孵育 45 分钟。孵育后，将板放入磁性板垫圈中，并像以前一样洗涤板后，将粘性板密封移液管30微升稀释的BV421标记的条他亲和素放入每个反应孔中。

然后将密封的板放在板振荡器上进行后续孵育。孵育完成后，洗涤板，并使用洗涤缓冲液将珠子重悬于孔内至最终体积为100微升。为了分析结果，用微孔板密封盖住96孔反应板。

接下来，在板振荡器上以每分钟 20 转的速度将覆盖的板在 1000 摄氏度下孵育三分钟。将板从振荡器转移到双报告器流量分析仪。最后，按照制造商的说明评估样品中值荧光强度或MFI。

对三种代表性疏螺旋体抗原的 Spearman 相关性分析表明，在检测人血清中存在的抗疏螺旋体抗体时，MFI 值具有一致的重现性。双报告基因检测显示出良好的检测间重现性，检测间精度高，如Levey-Jennings图表所示。在样品稀释度为 100 倍至 12、800 倍时，两种仪器的 IgM 检测和 IgG 检测的稀释曲线相似。

单报告基因仪器的MFI值略高。