Paraffin Embedding and Histopathological Scoring of Demyelinating Lesions and Perivascular Cuffs in Mouse Brain and Spinal Cord Tissues

首先，用剪刀剪下一小块镜头纸并将其放入培养皿中。接下来，将含有从小鼠分离的固定大脑和脊柱的福尔马林倒入衬有滤纸的漏斗中。将大脑和脊柱转移到空的培养皿中。

用手术刀将大脑分成六个冠状块。使用镊子，将脑标本转移到培养皿中透镜纸的一半上。用手术刀将脊髓切成三块，然后在尾端切开骶棘片，直到脊髓变得可见。

用非惯用手捡起胸椎。用惯用手紧紧闭合牙齿的 Adson 镊子，轻轻地将末端推入脊柱的较小开口，轻轻扭转。接下来，使用镊子，轻轻地将新兴的脊髓从柱子中拉出，将脊髓片放入装有晶状体纸的培养皿中。

使用手术刀，将三个脊髓片分成较小的横截面片。将这些碎片排列在包含大脑碎片的镜头纸的同一半部分。将镜头纸折叠成夹在纸巾夹层中，然后将其放入贴有标签的暗盒中。

将盒转移到装有福尔马林的标本罐中。孵育后，将样品盒从标本容器转移到自动组织处理器中的第一个福尔马林浴中，并运行处理器过夜。第二天，从组织处理器中取出盒并将它们转移到石蜡包埋站的温暖保温室中，倒入石蜡以覆盖模具底部。

使用细镊子，将脑冠状动脉和脊髓横截面片放入模具底部的石蜡中。将模具转移到冷却表面上几秒钟，以将大脑和标本固定到位。将模具移回加热表面，并用热石蜡填充到顶部。

将标有试样 ID 的盒盖放在模具上。将石蜡倒在盒盖上。将模具转移到冷却站，让蜡凝固。

块完全冷却后，将块固定在旋转切片机上。修剪石蜡块并切割每个石蜡块的五微米部分。将石蜡带移至 42 摄氏度的水浴中。

将切片从水浴中收集到贴有标签的载玻片上。将载玻片放在塑料载玻片架中，然后在干烤箱中以 37 摄氏度烘烤过夜。扫描完成后，打开图像 J，然后拖放该部分的 tiff 图像进行分析。

观察四个象限的脊髓切片，并对每个象限中是否存在脱髓鞘病变进行评分。该部分的得分为 4，因为所有四个象限都有病变。该部分得分为 1，因为病变仅在一个象限中。

CD45 染色提示病变中存在白细胞。与旧病变相比，新病变含有许多 CD45 细胞。相比之下，与旧病变相比，新病变可能含有较少的 SMI-32 阳性轴突。

野生型组小鼠出现严重EAE并伴有完全瘫痪。而OGR1-KO组则发展为轻度疾病。临床评分的这种差异对应于脑膜下脱髓鞘化病变的变化，脊髓中染色的髓鞘面积百分比，此外，OGR1 和野生型小鼠之间的髓鞘分数百分比也显着差异，并且与累积 EAE 评分相关。

在EAE中，大脑中的炎症主要局限于小脑和脑干。其他炎症区域可能在大脑中明显，包括脑膜、脑室附近以及其他白质轨迹，如视神经和胼胝体。与健康小鼠相比，用小分子阵列测定法测量的血清神经丝光检测到 EAE 小鼠的血清神经丝光水平更高，这些升高的水平与脊髓中 SMI-32 阳性的密度相关。