在超洁净工作台上，在无菌条件下工作时，进行角膜缘生态位细胞（LNC）的分离。从中间角膜储存介质中取出角膜缘组织。使用无菌手术圆刀片，刮擦并去除角膜周围的虹膜和内皮。
接下来，用无菌手术圆刀片将角膜缘组织切成 12 等份，在角膜和巩膜两侧只留下一毫米的组织。之后，将 12 块角膜原组织块转移到 35 毫米培养板中，并加入 1 毫升胶原酶 A 以将组织完全浸入培养板中。通过将培养板在37摄氏度细胞培养箱中孵育18小时来消化组织。
在设置在4摄氏度的冰箱中解冻基质胶或基底膜基质。准备一个装有 200 微升和 1 毫升吸头的灭菌袋、一个 15 毫升离心管和一个 6 孔板，并将袋子置于零下 20 或零下 80 摄氏度下 20 分钟。从冷却器中取出吸头、离心管和 6 孔板后，继续在超洁净工作台上执行后续步骤。
使用预冷的 200 微升吸头，将 50 微升解冻的基底膜基质移液到 1 毫升 MESCM 中，然后轻轻混合。使用安装在移液器上的预冷 1 毫升吸头，将所得的 5%基底膜基质转移到预冷的 6 孔培养板的单个孔中。水平轻轻摇动 6 孔板，然后将其置于 37 摄氏度的培养箱中约一小时以制备 5% 基质凝胶包被的培养板。
消化 18 小时后，取回胶原酶 A 消化的角膜缘组织，主要含有可见的小簇。在立体显微镜下工作，使用200微升移液器吸头将簇从未消化的巩膜组织中分离出来。将分离的簇浸没在 0.25%胰蛋白酶-EDTA 中 35 毫米培养板中，并将板孵育 15 分钟。
然后，在平板中加入 1 毫升含有 10% 敲除血清的 MESCM 以淬灭细胞消化。用 1 毫升移液器吸头轻轻上下移液悬浮液，将簇分解成单个细胞。将细胞悬浮液转移到15毫升离心管中，并在室温下以200G离心5分钟。
在不干扰细胞沉淀的情况下，小心地除去上清液，并加入 1 毫升 MESCM 以重悬细胞。使用 1 毫升移液器吸头，上下移液内容物两到三次，以确保整个沉淀重悬于 MESCM 中。从悬浮液中收集 20 微升用于细胞计数。
接下来，使用1毫升移液管，将细胞悬浮液转移到5%基底膜基质包被的6孔板中。加入MESCM使孔中的总体积为2.5毫升。水平轻轻摇动 6 孔板，以确保细胞均匀分布。
对细胞进行成像后，将它们转移到 37 摄氏度的细胞培养箱中。所展示的方案成功地消化了角膜巩膜边缘组织，产生了可以在显微镜下可视化的簇。不出所料，这些簇类似于毛毛虫的形状。
原代LNC生长缓慢，培养时间约为12天。从第1传到第8传的LNCs大约需要3 d才能传代，但第9传代后LNCs的生长速率显著下降。从形态学上讲，LNCs在0传代中呈纺锤形和圆形。
在第 3 次传代后，它们呈纺锤形，尺寸均匀。细胞倍增数或NCD代表LNC的生长速率。NCD和累积NCD曲线显示，LNCs从第3传到第5传的生长最快。
