为了通过免疫荧光染色鉴定角膜缘生态位细胞或LNC,每孔向在5%基质胶包被的6孔板中培养的LNC中加入1毫升0.25%胰蛋白酶EDTA。通过在 37 摄氏度下孵育板五分钟来消化细胞。通过向细胞悬液中加入 1 毫升含有 MESCM 的敲除血清来淬灭消化。
将细胞悬浮液转移到离心管中,并在小心吸出上清液之前将其离心200G五分钟。将沉淀重新悬浮在一毫升MESCM中。接下来,使用细胞吸凝机,按照制造商的说明将 80 微升细胞悬液均匀地沉积在四个显微镜载玻片上。
用 4% 多聚甲醛固定细胞约 10 分钟。然后使用0.2%Triton X-100在PBS中透化载玻片上的细胞15分钟。用 2% 牛血清白蛋白封闭细胞一小时,然后将它们与一抗在 4 摄氏度的振荡器上孵育过夜。
孵育后,通过用PBST洗涤载玻片三次,每次五分钟,除去未结合的抗体。接下来,将样品与合适的二抗在 37 摄氏度下孵育一小时,然后如前所述清洗任何未结合的抗体。用浓度为每毫升 5 微克的 DAPI 对细胞核进行复染。
密封载玻片后,使用荧光显微镜进行成像。使用RNA分离试剂盒,按照制造商的说明从LNC中提取总RNA。然后使用高容量互补 DNA 或 CDNA 转录试剂盒,逆转录 1 至 2 μg 的 RNA。
制备含有 2.5 微升 CDNA、0.8 微升相应遗传引物、10 微升通用 PCR 预混液和 6.7 微升双蒸水的 20 微升溶液。然后使用适当的条件进行定量聚合酶链反应。最后,采用比较CT技术检查相对基因表达。
对第四次传代LNCs进行双重免疫染色,结果显示这些细胞一致为panCK阴性、VIM阳性、CD90阳性、CD105阳性、SCF阳性和PDGFR阳性。