Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

要开始使用血清移液管，请从含有 70% 汇合 MDA-MB-231 培养物的 T75 烧瓶中取出生长培养基。在烧瓶中加入三毫升胰蛋白酶，并在 37 度下与 5% 二氧化碳一起孵育三到五分钟，以将细胞从烧瓶中分离出来。然后中和胰蛋白酶，在烧瓶中加入三毫升DMEM。

将细胞悬液收集在离心管中，并以400G旋转四分钟。使用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于两毫升PBS中。使用细胞计数器，确定细胞浓度。

将 8 次 10 转移到第 5 个细胞中，放入 15 毫升管中，并加入 PBS 使体积达到 1 毫升。然后将两微升CFSE加入试管中，并使用一毫升移液管充分混合细胞悬浮液。将试管置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳培养箱中 20 分钟。

接下来，向试管中加入 5 毫升 DMEM，然后离心以沉淀 CFSE 标记的细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于一毫升DMEM中。重新评估细胞浓度后，将四倍 10 转移到第 5 个细胞中，放入 25 毫升试剂储液器中。

加入DMEM使体积为8毫升，并将细胞悬液与5毫升血清移液管混合。使用多通道移液器，将 100 μL 细胞悬液转移到黑色 96 孔板左半部分的每一行中。同样，在板的右半部分添加EGFR敲除细胞悬浮液。

为确保细胞分布均匀，请在平台上来回和左右移动板。将平板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 4 小时，以便肿瘤细胞附着。根据未转导和表达 CAR 的 Jurkat 细胞的计数，将 4 倍 10 转移到第 5 个 CAR-J 细胞中，进入 25 毫升储液器。

将 DMEM 添加到储液罐中，最终体积为 2 毫升。对于4：1的效应子与肿瘤的比例，在不干扰附着的肿瘤细胞的情况下，在沿孔侧面的100μL培养基中，向每孔的第四个CAR-J细胞添加两倍10。然后在含有肿瘤和 Jurkat 细胞的孔的一侧加入 100 微升 DMEM，以获得每孔 300 微升的体积。

如图所示移动板，以确保Jurkat细胞在肿瘤细胞上的均匀分布。让共培养物在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下建立 48 小时。