首先,用 12 毫升 DM EM F12 稀释一小瓶解冻的冷基底膜基质。将悬浮液充分混合。在 24 孔板的每个孔中加入一个盖玻片。
然后,将 250 微升稀释的基质溶液移液到每个孔中。丢弃培养的hESC衍生的视网膜色素上皮细胞板的培养基。每孔用一毫升预热的 PBS 洗涤板两次。
接下来,将 0.5 毫升细胞解离试剂加入培养板的孔中,并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟以开始消化。孵育后,在显微镜下观察细胞以确认消化结束。现在使用 1 毫升移液管,轻轻地上下移液细胞悬液 10 次。
加入预热的培养基以稀释悬浮液。然后,在室温下以 250 G 离心 3 分钟。从离心管中倒出上清液。
然后,将细胞沉淀重新悬浮于两毫升培养基中。使用移液管将细胞混合 10 至 15 次。通过 40 微米细胞过滤器过滤细胞悬浮液。
接下来,对视网膜色素上皮细胞进行计数。在电镀前吸出涂层溶液。然后,向每个孔中加入一毫升培养基,并将细胞接种在盖玻片上。
EDU掺入和染色后,用荧光显微镜捕获五个随机场的图像。计算 EDU 阳性细胞的百分比。然后,绘制相应的比例时间曲线以生成增长曲线。
最后,确定每个细胞系的指数期的冻结窗口。视网膜色素上皮细胞最初失去了其特有的六边形形态,但后来在生长的指数阶段又恢复了它。当细胞再培养一周时,细胞增殖减少。
EDU增殖试验证实,P2 d 5细胞表现出更高的增殖率,而P2 d 11细胞已进入减速期。