首先,解离 hESC 衍生的视网膜色素上皮细胞,制备细胞悬液,然后对细胞进行计数。现在,在室温下以 250g 离心细胞三分钟。倒出上清液,然后将细胞沉淀重悬于冻存培养基中。
接下来,将 1 毫升细胞悬液转移到 1.2 毫升低温小瓶中。将低温瓶放入冷冻容器中,并在零下 80 摄氏度下冷冻过夜。将小瓶转移到液氮中进行长期储存。
为了解冻冷冻小瓶,首先将加热到37摄氏度的金属珠中的培养基加热,然后将10毫升加热的培养基预填充到15毫升的管中。现在,从液氮中取出低温小瓶,并将它们放入自动解冻系统中以进行快速解冻。将 0.5 至 1 毫升预热的培养基滴入低温瓶中,以确保细胞逐渐适应。
然后,将 1.5 至 2 毫升的细胞悬液移液到装有培养基的 15 毫升管中。在室温下以 250g 离心细胞 3 分钟。然后,丢弃上清液。
将沉淀重悬于两毫升温热培养基中。将细胞加载到血细胞计数器中并对其进行计数以确定恢复率和存活率。在含有 Y27632 的培养基中将解冻的细胞培养在基底膜包被板上。
在第5天冷冻的视网膜色素上皮细胞在其指数期解冻后表现出更高的附着率。相对于其特有的六边形形态,在其他时间点冷冻的细胞具有成纤维细胞表型。P2 第 5 天细胞在解冻 28 天后表现出更高的表达和更正确定位的细胞标志物。
值得注意的是,不同的冻存培养基在实现解冻后的高细胞活力和附着方面表现同样出色。