首先，将细胞培养插入物放入 24 孔组织培养适配器板中。在肠生长培养基中用 100 μL 基底膜细胞外基质或 BME 预涂插入物的顶端侧。涂上额外的嵌件，以便在屏障完整性测量期间用作对照。
接下来，将涂层插入物在 37% 二氧化碳下在 5% 二氧化碳下孵育一小时。孵育完成后，吸出 3D 肠培养基。在 1 毫升冰冷洗涤介质中收获牛回肠肠样。
使用细胞刮刀拆下圆顶并将它们收集到 15 毫升锥形管中。用 1 毫升移液器吸头研磨 30 次以生成肠样碎片。接下来，使用 200 微升移液器吸头进一步研磨约 40 次以分解肠样碎片。
用冰冷的洗涤介质将试管的体积补足至 10 毫升。然后在室温下以300g离心管5分钟。小心吸出上清液，包括BME层。
接下来，对于每四个圆顶，将沉淀重悬于1毫升预热的TrypLE表达酶中。将混合物转移到 24 孔板中，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳下孵育 10 分钟。用 1 毫升移液管轻轻移液混合物，以进一步分解类肠。
然后用 200 微升移液管移液将混合物分解成单个细胞。使用装有无菌 22 号针头的 3 毫升注射器抽吸并分配细胞悬液四次，以实现单细胞悬浮液。用显微镜监测细胞解离，直到 80% 的类肠分解成单个细胞。
现在将细胞悬液收集到15毫升锥形管中。加入四体积的FBS洗涤介质以淬灭反应。然后通过预涂层的 40 微米细胞过滤器将肠道类化合物过滤两次到 50 毫升锥形管中。
将悬浮液以300g离心五分钟，使细胞沉淀出来。将上清液吸入解离的牛回肠样细胞悬浮液的离心管中。将沉淀重悬于少量类器官生长培养基中。
接下来，使用台盼蓝染料排除法和血细胞计数器确定细胞活力。小心地从细胞培养插入物中去除任何多余的包衣溶液。将 200 μL 的单细胞悬液接种在预包被培养插入物的顶端表面上。
现在将 700 μL FBS 完全培养基添加到插入物的基底侧侧。以数字 8 的形状移动板约 10 次，以将细胞均匀分布在插入物上。然后将盘子放在生物安全柜的暖板器上 10 分钟。
在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育板 48 小时。孵育后，用新鲜的肠生长培养基替换顶端和基底组分上的培养基。第二天，从顶端和基底侧室中取出培养基。
用PBS仔细洗涤插入物，并用仅补充抑制剂的肠分化培养基代替。在培养板状牛隐窝后数小时观察到肠球形成。两天后，球体的管腔清晰，在第四天观察到萌芽结构。
到第7天观察到成熟的类肠。对 7 天龄的 3D 类肠动物进行免疫染色，显示存在不同的细胞谱系。E-钙粘蛋白定位于粘附连接处。
类肠细胞对肠内分泌细胞和产溶菌酶潘氏细胞呈阳性。在不到一周的培养中观察到融合的 2D 单层。
