Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

首先，用 HEPES 缓冲 E3 培养基或 E3 制备 1.8% 琼脂糖板。在解剖显微镜下工作时，将6至10个麻醉的幼虫排成一排放在琼脂糖平板上。在每个幼虫的头上放一个昆虫别针。然后用纸巾从板上取出剩余的 E3。

使用另一个昆虫别针，在不干扰任何其他器官的情况下将肠道与幼虫隔离开来。确保正确去除蛋黄。分离后，检查肠道并去除所有非肠道物质，例如皮肤、脂肪或肝脏。

使用镊子收集肠道并将其转移到放置在冰上的微量离心管中含有10%FCS的PBS。解剖所有肠后，立即将微量离心管以13,800g离心30秒。除去上清液，在管中留下约100微升，以防止肠变干。

在试管中向肠道中加入500微升木瓜蛋白酶溶液。通过加入 2.5 微升一摩尔半胱氨酸来激活木瓜蛋白酶。然后将装有肠子的试管在 37 摄氏度的水浴中孵育 10 分钟。

五分钟后，将内容物上下移液一半，以刺激酶组织消化。通过预先焊接的 35 微米细胞过滤器将解离的细胞转移到荧光激活细胞分选管 （FACS） 中。将含有 10% FCS 的 0.5 毫升 PBS 添加到总洗涤量为 2 毫升的 PBS 中多次清洗过滤器。

将收集的滤液在700g下在4°C下离心5分钟，并除去上清液。将每毫升DAPI加入300微升含有10%FCS的PBS中。将该混合物添加到沉淀中并重悬以标记死细胞。

然后在冰上孵育五分钟，以便在随后的FACS分析中将其排除。